Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Özet

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Özet

Jartiyer yılan kas abdominis dört boyutlu (4D) görüntüleme hafif ince transversus motor sinir terminalleri içinde küçük yapıların davranışlarını incelemek için kullanılır olmuştur. Ham veri 3D z yığınlarının time-lapse dizileri içerir. Her yığın 400-1,500 nm ayrılmış odak uçakları epifluorışıma optik ile edinilen 4-20 görüntülerini içerir. Bu tür odak ayarı olarak görüntü yığınlarından edinimi adımlar, uyarma dalga boylarında anahtarlama ve dijital kamera operasyon, görüntü oranını maksimize etmek ve ışık maruz kalma doku hasarı en aza indirmek için mümkün olduğunca otomatik vardır. Kazanılmasından sonra, görüntü yığınlarının bir dizi uzamsal çözünürlüğü artırmak için deconvolved edilir, istenen 3D formatına dönüştürülmüş ve bir 4D "film" olduğunu aranan deneysel verilere bağlı olarak, bilgisayar tabanlı analizler çeşitli için uygundur oluşturmak için kullanılır. Bir uygulama sinir terminalleri-macroendosomes bulunan endozomların iki sınıf (MES) dinamik davranış çalışmadırve (AE)-büyüklükleri (her iki tipi için 200-800 nm) asidik endozomlar difraksiyon sınırı ya da yakınında bulunmaktadır. Her zaman noktasında 3D bilgilere erişim geleneksel time-lapse görüntüleme üzerinde çeşitli avantajlar sağlamaktadır. Özellikle de, boyut ve yapıların hareket hızı keskin bir odak kaybı olmaksızın zaman içinde ölçülebilir. 4D görüntüleme veri örnekleri onlar ekzositozlanmış yerine sadece dikey olarak uzak odak tek bir düzlemde hareket ediyor düşündüren, ME'ler plazma zarı yaklaşım ve yok olduğunu ortaya koymaktadır. Aynı zamanda, her üç ortogonal çıkıntılar görüldüğü gibi, iki boya içeren yapılar arasındaki örtüşme ile görselleştirme ME'ler ve AE'lerin varsayılan füzyon olduğunu ortaya çıkardı.

Giriş

Canlı doku Time-lapse görüntüleme zaman içinde tek bir noktada görüntülü sabit veya yaşayan hazırlıkları takdir edilemez dinamik yapı-işlev ilişkilerinin görsel erişim sağlar. Çoğu zaman, ancak, zamansal bilgilere erişim için takas optik çözünürlükte bir azalmadır. Yüksek sayısal açıklık yağ daldırma hedefleri tek alternatif olarak su daldırma veya kuru hedefleri bırakarak, çünkü odak onların dar aralık doku yaşayan pratik değildir. Ayrıca, konfokal optik tarafından sağlanan artan çözünürlük aydınlatma nispeten yüksek seviyelerde ^1,2 gereken ikinci fototoksisite nedeniyle bazı oturma terkiplerde kullanılabilir olamaz. Birkaç gerçek zamanlı ya da time-lapse optik teknikleri sunan gelişmiş çözünürlük mevcut iken son olarak, onların uygulanabilirliği ilgi yapıları hedefi ¹ birkaç yüz nanometre içine yerleştirilmiş olabilir hazırlıklarına sınırlıdır. Tarif edilen yöntem,, nispeten düşük maliyetli ekipman kullanan çok yönlü, henüz daha yaygın kullanılan time-lapse teknikleri ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş çözünürlük sunuyor. Bu, her laboratuvar hem de görüntüleme tesislerde kullanım için tasarlanmıştır.

Yöntem, bir hassas dijital kamera ile ve hızlı bir şekilde biraz farklı odak düzlemleri (z-yığınları) de görüntülerin setleri elde etmek için tasarlanmış donanım ile birlikte, geleneksel epifloresans mikroskobu kullanır. Her z-yığın dijital çözünürlüğü artırmak için deconvolved edilir. 3D time-lapse (4D) görüntüleme bir özelliği organellere veya diğer yapıların hareketli hassas takip olduğunu. Düzgün kurduğunuzda, görüntülü yapılar odak dışarı çıkmayın ve her üç yönde hareketi gözlenen ve sayısal olabilir. Lekeli bir yapı sadece dar bir odak düzlemi üzerinde veya altında sürüklenen bir veya daha fazla zaman atlamalı çerçeveleri içinde kaybolur için Böylece imkansızdır. Yöntem, aynı zamanda olası etkileşimleri ve fu değerlendirmek için hassas bir araç olarak hizmet vermektedirKüçük yapılarda sion. Konvansiyonel epifluorışıma veya kırınım sınırı (birkaç yüz nm) yakın yapıların konfokal görüntüleri birleştirilmiş görüntüleri kendi etiketleri ³ çakışmasını göstermek bile füzyon onaylamak değildir. Füzyon önerilen, ancak bu nesnelerin kırınım sınırın altında olan bir mesafe ile yatay veya dikey olarak ayrılır mümkün kalır. Üç ya da dört-boyutlu görüntüleme, aksine, üç ortogonal yönün her birindeki nesnelerin görüntüleme izin verir. Üç görüş füzyon görünümü kesinlik düzeyini arttırır. Ve bazı yaşam hazırlıklar, yönettiği ya da her iki etiket zaman birlikte hareket zaman varsayımsal kaynaşmış nesnelerin Brown hareketi başka kanıtı sağlar. Tabii ki, zaman kırılma sınırına yakın kökenli seçici yapılarda kesinlik veya iki boyalar (füzyon) içerdiğini gösteren düzeyi, mutlak değildir. Eğer böyle bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) uygulanabilir, özel teknikler,^4, daha uygundur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. Supravital Boyaları ile Hazırlama Leke

1. Jartiyer yılan diseksiyon protokolü için Stewart et al. ⁵ ve Teng et al. ⁶ Sürüngen doku daha uzun süre için fizyolojik kalır ve daha az bakteriyel kirlenme ile, (aşağıya bakınız), düşük sıcaklıklarda saklandığında. Memeli doku genellikle oda sıcaklığında ya da daha yüksek tutulur.
2. Lızozomal vital boya boyama için, soğuk bir sürüngen Ringers çözeltisi 1:5,000 (0.2 uM) 'de boya çözülür. 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Soğuk Zil sesleri ile birkaç kez yıkayın. Kısa sürede görüntü.
3. KCl stimulasyonla FM1-43 boyanması için, yüksek KCl Ringers 1:500 (7 uM) 'de boya seyreltin. 30-60 saniye maksimum boyunca 4 ° C'de inkübe edin. ~ 1 dak / durulama, soğuk Zil sesleri hızlı bir şekilde üç kez yıkayın. Kısa sürede görüntü.
4. Hipertonik (sakaroz) stimülasyon FM1 kullanılarak 43-boyama için, yukarıdaki gibi 0.5 M sukroz Ringers 'de boya seyreltin. 4 & # inkübe176, 2-5 dakika boyunca C. Soğuk Ringers yukarıda aşama 1.3 'de olduğu gibi yıkayın. Kısa sürede görüntü.
5. FM1-43 boyanması için elektriksel uyarım yoluyla, Teng et al. ⁶ Kısaca bakınız, preparasyon, fizyolojik tuzlu su solüsyonu ve boya içeren bir yemek verilmiştir. Sinir 200 mikro saniye olduğu dikdörtgen darbeler (~ 7 V, 30 Hz, 18 mikro-saniye) önceden programlanmış tren ile uyarılır. Soğuk Ringers yukarıda aşama 1.3 'de olduğu gibi yıkayın. Kısa sürede görüntü.

2.. Görüntüleme Hazırlık yapılandırma

1. Ilgi yapıları mikroskop objektif mümkün olduğunca yakın olacak şekilde hazırlık yönlendirin.
2. Bir ters mikroskop kullanılırsa, bunun taban ince yuvarlak kapak kayma içeren bir bölmeyi kullanmaktadır. Tipik olarak görüntüleme odası merkezde bir 25 mm çaplı 1. kalınlığında cam kapak kayma ile bir ince paslanmaz çelik alt olmalıdır. Dik bir mikroskop kullanılırsa, bir alt lamel gereken ancak yararlı değildiriletilen ışık görüntüleme izin vermek (örneğin diferansiyel girişim kontrast, DIC) numune yönlendirmek ve ilgi nesneleri bulmak için.
3. Mümkün olan en yüksek 3D çözünürlüğünü elde etmek için uygun bir hedefi seçin. Makasına sayısal diyafram lens (na), çalışma mesafesi, büyütme ve tip arasında bulunmaktadır (kuru, su ve yağ daldırma). Doku kültürleri gibi ince hazırlıkları için, petrol hedefleri en iyisidir. Dik bir mikroskop kullanılarak, sulu banyo üzerinde bir kapak kayma şamandıra ve kapak kayma üst ve hedefi arasında daldırma yağı kullanın.
4. Dekonvolüsyon yazılım kullanılırsa, satıcı belirli amaçlar için önceden belirlenmiş nokta yayılım fonksiyonu (PSFs) sağlayabilir. Böyle bir bilgi verilmedi, ya da desteklenmeyen bir objektif seçilirse, floresan mikro noktalar veya benzer kırılma sınırlı nesneleri ^7,8 görüntüleme ile PSF tespit edilir ise.

3.. İstenilen Alan derinliği ve Ima sayısı KurmakTime-lapse Frame başına İstenilen ges

1. Alan toplam derinliğini seçin, böylece hareketli veya ilgi yapılar kaybolur ya da z-doğrultusunda hareket olarak odak dışına çıkmayın etkileşim. Z-alan biraz görüntüsü alınan hücre veya hücre işleminin dikey boyut aşmalıdır. Omurgalı, motor terminalleri için, 15-20 mikron tipiktir.
2. Odak lik her bir fazlalık için gerekli olan z ekseni adım hesaplayın. Z ekseni boyunca ebatları amacın özelliklerine bağlı olarak değişir; xy düzlemi çözünürlük yaklaşık dörtte biri. Konfokal görüntüleme veya dekonvolüsyona tabi tutulması, yazılım ya da kullanılırsa, z ekseni çözünürlüğü artar. Z-yönünde ⁵ kasıtlı Oversampling tarafından nihai çözümünü geliştirmek, aynı zamanda aşağıya 3.3 adıma bakın. Tipik bir adım aralığı: 40-100X amaçları için 400-1,500 nm aralığındadır. Işık her z-adım görüntü arasındaki kapalı kepenkli edilmelidir.
3. Z-yığını başına görüntü sayısını seçin, yani alan istenen derinliği bölünmüşadım arayla. Tipik bir z-yığını tamamlamak için zamanı 1-10 sn. Her resim düzlemi biraz farklı bir zaman noktasına karşılık çünkü hızlı hareket eden nesneleri (100 nm / sn) bir 3D görüntü yığını bulanık görünebilir. Ayrıca, her bir ek görüntü ağartmanın ve olası fototoksisite (Tartışma) katkıda bulunur. Her iki durum ilgiliyse, yığının başına daha az görüntüleri toplamak için büyük bir z-adım seçmek. Görüntü interpolasyon yazılımı (aşağıda adım 6.3) kullanılarak daha sonra dengeleyin.

4.. Time-lapse Frame Rate seçin

Sorunsuz böyle bir hareket, etkileşim ya da füzyon olayları ⁹ gibi zamanla değişiklikleri gidermek için sadece yeterli bir oran Deneyden tarafından seçin. Örnekleme gereksiz ışığa maruz artırırken örnekleme altında hareket eserler (örnekleme hataları) üretebilir. Tek bir uzun dizi veya aynı hazırlanması, nispeten küçük bir toplam zaman aralığı her bir (birkaç tekrar dizileri ya da toplamak örneğin 10 kez puan x 30 sn aralığı = 5 dk). Mümkünse, tüm hazırlık sürüklenme dahil, kabaca tahmin hareket hızları sürekli epifluorışıma aydınlatma ile hazırlık görüntülemek varsa.

5.. Belirli Hazırlama Tüm Canlı Görüntüleme tamamlayın

Sürüngen preparatları tipik soğutmalı uzun değilse, ~ 1-2 saat için sağlam kalır.

6.. İstenilen Kullanım göre Veri Analiz

1. Tüm ham veri dosyaları saklayın. Dijital depolama genellikle bir sorun değil iken, işlem süresi daha hızlı kişisel bilgisayar veya iş istasyonu ile önemlidir. Bu nedenle, faiz [ROI] bir bölgeye kırpma görüntüleri. Ilgi tüm bölgenin tüm zamanı sırasında kırpılan pencerenin olduğunu temin ederim.
2. Deconvolve görüntü uygun yazılım ve doğru nokta dağılım fonksiyonu kullanılarak yığınlar. Bu çözünürlüğü artar onaylayın ve hiçbir dışlayıcı tarafından oluşturuldudekonvolüsyon algoritma. Şekil 3. örnek görüntüleri gösterir.
3. Z-ekseni belirgin çözünürlük genişletmek için bir enterpolasyon algoritması kullanın. Belirgin bir 0.25 mikron ayırma gerçek bir 1.5 mikron görüntü düzlemi ayrılık bir 6X genişleme önerilmektedir. Alternatif olarak, örneklemedir bazı kombinasyonu (adım 3.2) ve interpolasyon kullanın.
4. Istenirse kontrast, parlaklık, gürültü filtreleme, photobleaching ve diğer tipik görüntü işleme ayarlamaları gerçekleştirin. Görüntü işleme standartları en bilimsel çalışma için, aynı düzeltmeler bir yığın içinde ve farklı zaman noktalarında hem de tüm görüntülere uygulanacak olması uygun olduğunu dikte. Belirli bir ayarlama sonucu tüm görüntülerin ⁹ arasında değerlendirilmelidir.
5. Veri ihracat için özel bir ekran modu seçmek. En basit göstergesi yeşil-kırmızı veya kırmızı-mavi anaglyphs (Şekil 3 örnekleri), stereo çiftleri, ya da alternatif ile stereo video righ / solt göz shutter gözlük çerçeveleri. Anaglyphs tek bir renk ile sınırlıdır. Z-ekseni görsel çözünürlüğünü artırmak için istenirse belirgin görüntü derinliği geliştirin.
6. Çeşitli filtreleme ve görüntü geliştirme teknikleri deneme. Örneğin, Laplasyen filtreleme arka plan üzerinde küçük yapılar kontrast arttırmak için yararlıdır. Çevresinde parlaklık azalır çalışan bir pencerenin merkezi piksellerin parlaklık geliştirilmiştir. Bazı filtreleme yöntemleri birlikte iyi çalışmaz unutmayın.
7. Zamanla hazırlanması önemli bir hareket varsa sürüklenme düzeltme uygulayın. Bu tür bir hareket uyuşturucu eylem potansiyelleri, sinaptik potansiyellerin bastırmak için ilave bile, canlı kas yaygındır. Bir piksel kayıt algoritma (örneğin. IMARIS, Adobe AfterEffects, ImageJ için TurboReg plugin) time-lapse görüntüleri hizalar ve azaltabilir, ancak genellikle tamamen böyle bir hareketi ortadan kaldırmak değil.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Gösterilen veriler (Şekil 3 düşük ve yüksek büyütme manzaralarını görmek; endositik boya (FM1-43) alımının her bouton doldurur bir pus oluşturur) yılan nöromüsküler terminalleri ve özellikle macroendosomes (MES) ve asidik endozomlar (AE) Bu terminallerde ⁵ içinde. ME'ler sinirsel aktivite ¹⁰ sırasında toplu endositoz tarafından oluşturulan ve etkinlik ⁶ bittikten sonra bunların sayısı zamanla katlanarak azalır edilmektedir. 4D canlı gör...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

4D görüntüleme en kritik yönü, ışığa maruziyet süresi ve yoğunluğu yönetimi. Photobleaching görüntü sinyal-gürültü oranı azalır ve Flüoroforlann seçimi dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlı olarak sorunlu olabilir ya da olmayabilir. Canlı doku (fototoksisite) için spesifik olmayan zarar ışıkla ağartma ile ilgilidir, ve bazen amaç için ^2,12 ya da diferansiyel girişim kontrast (DIC) gibi uygun optik aydınlık ile morfolojisinin incelenmesi ile tasarlanmış fluoresan ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
SGC5	Biotium, Hayward, CA	70057	Final conc: 10 mM
FM1-43FX	Invitrogen, Carlsbad, CA	F35335	Final conc: 7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen, Carlsbad, CA	L7528	Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
Sucrose			0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA	175W Xenon arc lamp	www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA		www.sutter.com
Sensicam CCD camera	Cooke Instruments, Tonawanda, NY		www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera	Photometrics, Tucson, AZ		www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO	Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane, South Windsor, CT	Drift correction; 3D and 4D data presentation	www.bitplane.com
AfterEffects CS6	Adobe, San Jose, CA	Drift correction	www.adobe.com
ImageJ 1.46	National Institutes of Health, Bethesda, MD	Multiple plugins available; Stereo pair construction	http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM	Carl Zeiss, Thornwood, NY	Stereo pair construction	www.zeiss.com