Visualisation des Endosome Dynamics dans Vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions d'imagerie par fluorescence

Résumé

Quatre dimensions (4D) imagerie est utilisée pour étudier le comportement et les interactions entre les deux types de endosomes dans les terminaisons nerveuses vertébrés vivant. Le mouvement de ces petites structures est caractérisé en trois dimensions, ce qui permet la confirmation des événements tels que la fusion des endosomes et l'exocytose.

Résumé

Quatre dimensions (4D) Imagerie de la lumière a été utilisé pour étudier le comportement des petites structures au sein terminaisons nerveuses motrices de la transverse de l'abdomen mince muscle de la couleuvre rayée. Les données brutes comprend des séquences de time-lapse de 3D z-piles. Chaque pile contient 4-20 images acquises avec une optique à épifluorescence à plans focaux séparés par 400-1,500 nm. Les étapes de l'acquisition de piles d'images, telles que le réglage de mise au point, la commutation de longueurs d'onde d'excitation, et le fonctionnement de l'appareil photo numérique, sont automatisées autant que possible pour maximiser le taux d'image et de minimiser les dommages aux tissus exposés à la lumière. Après l'acquisition, une série de piles d'images est une déconvolution pour améliorer la résolution spatiale, converties au format 3D désirée, et sert à créer un "film" 4D qui est appropriée pour diverses analyses sur ordinateur, en fonction des données expérimentales recherchées. Une application est l'étude du comportement dynamique de deux classes de endosomes trouvés dans nerveuses bornes-macroendosomes (ME)et endosomes acides (EI)-dont la taille (200-800 nm pour les deux types) sont à ou près de la limite de diffraction. Accès à l'information 3D à chaque point de temps offre plusieurs avantages par rapport à l'imagerie time-lapse classique. En particulier, la taille et la vitesse de déplacement de structures peuvent être quantifiés dans le temps sans perte de netteté. Des exemples de données de l'imagerie 4D montrent que les ME se rapprochent de la membrane plasmique et disparaissent, ce qui suggère qu'ils sont exocytosed plutôt que de déplacer simplement verticalement à une distance à partir d'un seul et même plan de mise au point. Est également révélé fusion putatif de ME et EI, par visualisation de chevauchement entre les deux structures contenant un colorant telles que vues dans chacune des trois projections orthogonales.

Introduction

Imagerie time-lapse de tissu vivant offre un accès visuel à dynamiques des relations structure-fonction qui ne peut être apprécié dans les préparations fixes ou vivant imagées en un seul point dans le temps. Souvent, cependant, l'arbitrage pour l'accès à l'information temporelle est une diminution de la résolution optique. Ouverture numérique des objectifs élevés huile d'immersion ne sont pas pratiques dans les tissus vivants en raison de leur gamme étroite de mise au point, laissant immersion dans l'eau ou les objectifs secs comme les seules alternatives. En outre, la résolution accrue offerte par l'optique confocale ne peut pas être utilisée dans certaines préparations de vie en raison de la phototoxicité des niveaux relativement élevés d'éclairement requis ^{de 1,2.} Enfin, alors que plusieurs techniques optiques en temps réel ou en accéléré sont disponibles qui offrent résolution améliorée, leur applicabilité est limitée aux préparations où les structures d'intérêt peuvent être positionnés à quelques centaines de nanomètres de l'objectif ^1. La méthode décriterend l'utilisation de l'équipement relativement peu coûteux, est polyvalent, tout en offrant une meilleure résolution par rapport aux techniques time-lapse plus couramment utilisés. Il est destiné à être utilisé dans les laboratoires individuels ainsi que des installations d'imagerie.

Le procédé utilise la microscopie à épifluorescence classique, combiné avec un appareil photo numérique sensible et avec du matériel destiné à acquérir rapidement des ensembles d'images légèrement différentes plans focaux (z-piles). Chaque z-stack est numériquement deconvolved pour augmenter la résolution. Une caractéristique de la 3D time-lapse (4D) imagerie est suivi précis des organites ou d'autres structures en mouvement. Lorsqu'il est correctement mis en place, les structures imagées ne sortent pas de mise au point, et le mouvement dans les trois directions peuvent être observés et quantifiés. Ainsi, il est impossible pour une structure teinté à disparaître sur un ou plusieurs cadres time-lapse seulement par la dérive au-dessus ou en dessous d'un plan focal étroit. La méthode est aussi un outil sensible pour évaluer les interactions et possible fusion de petites structures. Épifluorescence classique ou images confocales de structures proches de la limite de diffraction (quelques centaines de nm) ne confirment pas la fusion même si les images fusionnées montrent chevauchement de leurs étiquettes respectives ^3. Fusion est suggéré, mais il reste possible que les objets sont séparés horizontalement et verticalement par une distance qui est inférieure à la limite de diffraction. Trois ou à quatre dimensions imagerie, en revanche, permet la visualisation des objets dans chacune des trois directions orthogonales. L'apparition de la fusion dans les trois vues augmente le niveau de sécurité. Et, dans certaines préparations de vie, la direction ou le mouvement brownien des objets présumément fusionnés fournit une preuve supplémentaire lorsque les deux étiquettes se déplacent ensemble dans le temps. Bien sûr, quand près de la limite de diffraction du niveau de certitude dans les structures les plus exigeants de fond, ou montrant qu'ils contiennent deux colorants (fusion), n'est pas absolue. Le cas échéant, des techniques spécialisées, telles que le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET)^4, sont plus appropriées.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Colorer la préparation de colorants supravital

1. Pour le protocole de dissection des couleuvres voir Stewart et al. ⁵ et Teng et al. ⁶ tissus reptile reste physiologique pour des durées plus longues, et à la contamination bactérienne moins, lorsqu'il est conservé à basse température (voir ci-dessous). Un tissu de mammifère est généralement maintenu à la température ambiante ou plus élevée.
2. Pour lysosomale vital coloration de colorant, dissoudre le colorant dans reptiles 1:5000 de solution de Ringer froid (0,2 pm). Incuber à 4 ° C pendant 15 min. Lavez plusieurs fois avec Ringer froid. Image dès que possible.
3. Pour FM1-43 coloration à l'aide de KCl stimulation, diluer le colorant en haute KCl Ringers 1:500 (7 M). Incuber à 4 ° C pendant 30 à 60 secondes maximum. Laver rapidement trois fois avec Ringer froid, ~ 1 min / rinçage. Image dès que possible.
4. Pour FM1-43 coloration utilisant hypertonique (saccharose) stimulation, diluer le colorant dans 0,5 M sonneries de saccharose comme ci-dessus. Incuber à 4 & #176; C pendant 2-5 min. Laver comme à l'étape 1.3 ci-dessus avec Ringer froid. Image dès que possible.
5. Pour FM1-43 coloration par stimulation électrique, voir Teng et al. ⁶ En bref, la préparation est placé un plat contenant du sérum physiologique et le colorant. Le nerf est stimulé par un train préprogrammée de 200 microsecondes impulsions rectangulaires (~ 7 V, 30 Hz, 18 ps). Laver comme à l'étape 1.3 ci-dessus avec Ringer froid. Image dès que possible.

2. Configurez la préparation pour l'imagerie

1. Orienter la préparation de telle sorte que les structures d'intérêt sont aussi proches que possible de l'objectif du microscope.
2. Si un microscope inversé est utilisé, utiliser une chambre dont le fond contient une fine lamelle ronde. En règle générale, la chambre de formation d'image doit avoir un fond en acier inoxydable mince avec un diamètre de 25 mm # 1 en verre d'épaisseur lamelle au centre. Si un microscope droit est utilisée, une lamelle de fond n'est pas nécessaire mais elle est utilepour permettre l'imagerie de la lumière transmise (par exemple de contraste d'interférence différentiel, DIC) pour orienter l'échantillon et de localiser des objets d'intérêt.
3. Choisissez un objectif approprié pour obtenir la résolution la plus élevée possible 3D. Il ya des compromis entre ouverture numérique (NA), la distance de travail, agrandissement, et le type de lentille (sec, immersion dans l'huile à l'eau et). Pour les préparations minces comme des cultures de tissus, les objectifs de pétrole sont les meilleurs. En utilisant un microscope droit, flotter une lamelle sur le bain aqueux, et utiliser de l'huile d'immersion entre le sommet de la lamelle et l'objectif.
4. Si le logiciel de déconvolution est utilisé, le vendeur peut fournir des fonctions d'étalement de point prédéterminé (PSF) de certains objectifs. Si cette information n'est pas disponible, ou si un objectif pris en charge est choisie, déterminer la PSF par imagerie micro-pointes fluorescentes ou des objets de diffraction limitée similaires ^7,8.

3. Établir la profondeur de champ désirée et le nombre de Images souhaités par Time-lapse cadre

1. Sélectionnez la profondeur totale du champ de sorte que le déplacement ou l'interaction des structures d'intérêt ne disparaissent pas ou sortir de concentration qui se déplacent dans la direction z. Le champ de z doit légèrement dépasser la dimension verticale de la procédure de cellule ou cellule étant imagée. Pour les bornes du moteur vertébrés, 15-20 um est typique.
2. Calculer le pas de l'axe z nécessaire pour chaque incrément de mise au point. Résolution le long de l'axe des z varie en fonction des propriétés de l'objectif; il est d'environ un quart de la résolution du plan xy. Si l'imagerie confocale ou un logiciel de déconvolution est utilisé, la résolution de l'axe z est améliorée. Améliorer la résolution finale par suréchantillonnage délibéré dans la direction z ^5, mais aussi voir l'étape 3.3 ci-dessous. Un intervalle typique de l'étape est dans la plage de 400-1,500 nm pour les objectifs de 40 100X. La lumière doit être coffré off entre chaque image z-étape.
3. Sélectionnez le nombre d'images par z-pile, à savoir la profondeur de champ souhaitée diviséepar l'intervalle de l'étape. Temps requis pour remplir un z-stack typique est de 1-10 sec. Objets se déplaçant rapidement (100 nm / s) peuvent apparaître floue dans une pile d'images 3D car chaque plan image correspond à un point de temps légèrement différente. En outre, chaque image supplémentaire contribue à photoblanchiment et de phototoxicité possible (voir Discussion). Si les deux cas concerne, choisir un z-étape plus grande pour recueillir moins d'images par pile. Compenser plus tard en utilisant un logiciel d'interpolation d'image (étape 6.3 ci-dessous).

4. Sélectionnez le Frame Rate Time-lapse

Choisissez par l'expérimentation un taux qui est juste suffisant pour résoudre en douceur les changements avec le temps comme le mouvement, les interactions ou les événements de fusion ^9. Sous échantillonnage peut produire des artefacts de mouvement (erreurs d'échantillonnage), tandis que le suréchantillonnage augmente inutilement l'exposition à la lumière. Collecte, soit une longue séquence unique ou plusieurs séquences répétées de la même préparation, chacun avec un relativement faible intervalle de temps totale ( par exemple 10 points de temps x 30 sec d'intervalle = 5 min). Si possible, voir la préparation avec un éclairage à épifluorescence continue à estimer grossièrement les vitesses de déplacement, y compris la dérive de l'ensemble de la préparation si elle est présente.

5. Remplissez tous Imaging Live pour une préparation particulière

Préparations reptiles restent généralement robuste pour ~ 1-2 heures, plus si on le refroidit.

6. Analyser les données après utilisation désiré

1. Conservez tous les fichiers de données brutes. Tandis que le stockage numérique n'est généralement pas un problème, le temps de traitement est important, même avec des ordinateurs ou postes de travail personnels rapides. Pour cette raison, les images des cultures dans une région d'intérêt [ROI]. Assurez-vous que l'ensemble de la région d'intérêt est dans la fenêtre recadrée au cours du temps ensemble.
2. Deconvolve piles d'images en utilisant la fonction correcte propagation point un logiciel approprié et. Assurez-vous que la résolution est améliorée et qu'aucun artefact a été générée par lealgorithme de déconvolution. Figure 3 montre des exemples d'images.
3. Utiliser un algorithme d'interpolation d'étendre la résolution apparente de l'axe z. Une expansion 6X à partir d'un plan réel séparation d'image de 1,5 um à une apparente 0,25 um séparation est suggéré. Vous pouvez également utiliser une combinaison de suréchantillonnage (étape 3.2) et l'interpolation.
4. Effectuer le contraste, la luminosité, le filtrage de bruit, photoblanchiment et autres ajustements typiques de traitement d'image, si désiré. normes de manipulation de l'image dictent que pour la plupart des travaux scientifiques, il convient que les mêmes corrections être appliquées à toutes les images, à la fois dans une pile et à différents moments. La conséquence d'un réglage particulier devrait être évaluée chez toutes les images ^9.
5. Sélectionnez un mode d'affichage particulier pour l'exportation de données. L'affichage est plus simple vidéo stéréo en utilisant soit des anaglyphes rouge-vert ou rouge-bleu (exemples de la figure 3), des paires stéréo, ou en alternance gauche / droit œil cadres avec des lunettes à obturateur. Anaglyphes sont limités à une seule couleur. Améliorer la profondeur apparente de l'image si l'on souhaite améliorer la résolution visuelle de l'axe z.
6. Expérimenter diverses techniques d'amélioration de filtrage et de l'image. Par exemple, le filtrage de Laplace est utile pour augmenter le contraste des petites structures ci-dessus fond. La luminosité des pixels au centre de la fenêtre courante est améliorée tandis que la luminosité des zones environnantes est réduite. Notez que certaines méthodes de filtrage ne fonctionnent pas bien en combinaison.
7. Appliquer la correction de dérive si il ya un mouvement important de la préparation au fil du temps. Un tel mouvement est commun dans la vie muscle, même avec des médicaments ajoutés à supprimer des potentiels d'action et potentiels synaptiques. Un algorithme d'enregistrement de pixels (par exemple. D'Imaris, Adobe After Effects, le plugin pour ImageJ TurboReg) aligne les images en accéléré et peut réduire, mais généralement pas éliminer complètement, telle motion.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Les données présentées sont des terminaux serpent neuromusculaires (voir vues basses et hautes grossissement de la figure 3, le colorant d'endocytose (FM1-43) adoption crée une brume qui remplit chaque bouton) et, en particulier, macroendosomes (ME) et les endosomes acides (EI) à l'intérieur de ces bornes ^5. ME sont créés par endocytose vrac au cours de l'activité neuronale ¹⁰ et leur nombre diminue de façon exponentielle avec le temps après une activité a c...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

L'aspect le plus critique de l'imagerie 4D est la gestion de la durée et de l'intensité de l'exposition de la lumière. Photoblanchiment d'image diminue le rapport signal-sur-bruit et peut être problématique ou non en fonction de divers facteurs, y compris le choix des fluorophores. Non spécifique des dommages aux tissus vivants (de phototoxicité) est liée au photoblanchiment, et peut parfois être identifiée en utilisant des sondes fluorescentes conçus à cet effet ou ^2,12 par ex...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
SGC5	Biotium, Hayward, CA	70057	Final conc: 10 mM
FM1-43FX	Invitrogen, Carlsbad, CA	F35335	Final conc: 7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen, Carlsbad, CA	L7528	Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
Sucrose			0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA	175W Xenon arc lamp	www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA		www.sutter.com
Sensicam CCD camera	Cooke Instruments, Tonawanda, NY		www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera	Photometrics, Tucson, AZ		www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO	Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane, South Windsor, CT	Drift correction; 3D and 4D data presentation	www.bitplane.com
AfterEffects CS6	Adobe, San Jose, CA	Drift correction	www.adobe.com
ImageJ 1.46	National Institutes of Health, Bethesda, MD	Multiple plugins available; Stereo pair construction	http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM	Carl Zeiss, Thornwood, NY	Stereo pair construction	www.zeiss.com