النمذجة العفوي النقيلي سرطان الخلايا الكلوية (مركز تنسيق الانقاذ البحري) في الفئران بعد استئصال الكلية

Summary

نماذج من عفوية النقيلي سرطان الخلايا الكلوية (RCC) تطور المرض يمكن استخدامها لتقييم العلاجات في أجواء ذات الصلة سريريا. هذا البروتوكول يوضح إجراءات مختلفة لمثلي زرع الخلايا السرطانية في الكلى، استئصال الكلية السليمة، وتحدد في نهاية المطاف دليل التشريح للالتهديف البصرية وإضاءة الحيوية من العبء المنتشر والتعريب.

Abstract

واحدة من التحديات الرئيسية لتحسين اختبار علاجات تجريبية جديدة في سرطان الخلايا الكلوية (مجلس قيادة الثورة) هو تطوير النماذج التي ألخص بأمانة المبكر وأواخر مرحلة تطور المرض المنتشر. نماذج ورم زرع نموذجية الاستفادة خارج الرحم أو مثلي زرع الورم الرئيسي، ولكن قلة تشمل النظامية المرض المنتشر العفوي الذي يحاكي إعداد سريرية. يصف هذا البروتوكول الخطوات الرئيسية لتطوير مجلس قيادة الثورة مراحل تطور المرض مشابهة للمرضى. الأولى، فإنه يستخدم الماوس الورم النقيلي خط خلية غاية في نموذج مسانج لإظهار مثلي زرع الخلايا السرطانية. وتشمل أساليب غرس السطحية والداخلية في الفضاء دون المحفظة مع الخلايا جنبا إلى جنب مع matrigel لمنع تسرب وانتشار في وقت مبكر. المقبل فهو يصف إجراءات استئصال الورم الحاملة الكلى (استئصال الكلية)، مع الرعاية الماوس قبل وبعد العمليات الجراحية الحرجة. أخيرا، فإنه يحدد الخطوات اللازمة لرصد وتقييمالجزئي والكلي تطور المرض المنتشر، بما في ذلك التصوير للإضاءة الحيوية وكذلك يوفر دليل التشريح بصرية مفصلة ليسجل التوزيع أمراض جهازية. والهدف من هذا البروتوكول هو وصف لتسهيل الاستخدام واسع النطاق من نماذج RCC النقيلي ذات الصلة سريريا لتحسين القيمة التنبؤية لاختبار العلاجية في المستقبل.

Introduction

السبب الرئيسي للوفيات في المرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الكلوية (مجلس قيادة الثورة) هو المرض المنتشر النظامية التي تحدث عادة بعد الاستئصال الجراحي للورم الأولية نموا في الكلى. ومع ذلك، عدد قليل جدا من النماذج الورم قبل السريرية تقييم العلاجات التجريبية في الفئران وتشمل المرض المنتشر، وأقل ما زال ألخص بأمانة المراحل السريرية لنمو المترجمة، والجراحة، وعفوية بدء الصغرى النقيلي والتقدم ^1-3. أصبحت هذه الفجوة في اختبار متزايد الأهمية في تقييم علاجات جديدة وأحيانا ضرب تأثيرات مضادة للورم ينظر في النماذج الحيوانية لم تترجم دائما إلى العلاج الناجح بالمثل من المرضى ^4. هذه الاختلافات في النتائج قد تنبع من كفاءات المخدرات الفرق بين النماذج المترجمة الورم الرئيسي خارج الرحم أو مثلي ووقت متأخر من مرحلة المرض المنتشر ^5-7. في حالة قيادة الثورة، فقد استخدمت سوى عدد قليل من الدراسات أنشأتنيمال البروتوكولات التي تشمل المرض المتكررة العفوي الذي يحاكي المرضى الذين لديهم عادة الكلى الحاملة للورم كليا أو جزئيا إزالة ^2،3. تختلف أسباب هذا النقص في اختبار نموذج الفأر. أولا، هناك تكلفة عالية الحيوانية والتنوع الكامن الورم تحديد الخلية والمحتملة النقيلي. على سبيل المثال، خطوط الخلايا البشرية تميل إلى الكلى نادرا ما تنتشر، ويجب تحديد مدى جولات متعددة من زرع مثلي الأولية واختيار النقيلي لاشتقاق المتغيرات التي تنشر باستمرار وتشكل الآفات البعيدة (انظر وصف هذا خط الخلية اشتقاق الإنسان ^8-10) . على العكس، خلايا فأر في نماذج مناعيا تميل إلى التصرف بعدوانية، ويجب أن يتم حقنه أعداد الخلايا منخفضة مع matrigel للحد من انتشار النظامية فورا ^3. الثانية، والصعوبات التقنية في أداء زرع السليم، استئصال الجراحي (استئصال الكلية)، وتتبع (وقياس) metastati عفويةج النمو يمكن أن يكون تحديا والعديد من المتغيرات الحرجة في حاجة الاعتبار عند توظيف هذه التقنية (انظر مناقشة للتفاصيل). الغرض من هذا البروتوكول هو لوصف الخطوات الأساسية (فضلا عن المزالق المحتملة) من زرع مثلي، استئصال (استئصال الكلية)، ورصد عفوية المرض المنتشر ومجلس قيادة الثورة لتقديم التوجيهي لموحدة (وأكثر انتشارا) استخدام بين المختبرات العلمية أن تقييم فعالية العلاجات التجريبية.

Protocol

1. مثلي ورم الكلى زرع

1. الثقافة الخلية
   1. قبل زرع مثلي، وتنمو خلايا فأر رينكا ^لوك كما أحادي الطبقة إلى 75٪ confluency.
   2. التالية trypsinization وإعادة تعليق في 5٪ FBS تحتوي على وسائل الإعلام، والخلايا الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتكرار 3 مرات لغسل في برنامج تلفزيوني. ثم resuspend الخلايا في وسائل الإعلام خالية من المصل إلى تركيز 5 × 10 ⁴ رينكا ^لوك / 5 ميكرولتر المصل خالية سائل الإعلام.
      ملاحظة: اعتمادا على متغير أو خط الخلية المستخدمة، وخلايا يمكن معلق في نسبة 1:1 من matrigel وسائل الإعلام الحرة المصل لإبطاء نمو الخلايا شديدة العدوانية الماوس ونشرها بعد الزرع.
2. جراحة زرع الخلايا و
   ملاحظة: جميع الدراسات على الحيوانات المذكورة فيها، بما في ذلك الصيانة وتحديد نقاط النهاية التجريبية، وأجريت وفقا للجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUC) عrotocol التي وافق عليها معهد روزويل بارك للسرطان.
   1. تخدير واحد الماوس BALB / C باستخدام isoflurane و(2-3٪). قرصة القدم والتحقق من وجود منعكس لضمان تخدير كافية. تطبيق مرهم البيطرية للعيون لمنع جفاف. وضع الماوس في الاستلقاء الجانبي الأيمن والجانب الأيسر يحلق بين الصدارة والقائمة الخلفية. تطبيق الكحول واليود على طول المنطقة القطنية الظهرية لإعداد جو معقم و مطهر لمنطقة شق.
   2. استخدام مقص جراحي لبدء 1 سم شق الجلد في الاتجاه الطولي بين الضلع الماضي ومفصل الورك. ترخي النسيج الضام تحت الجلد باستخدام مقص تشريح حادة. استخدام مقص جراحي لإجراء شق 0.5 سم في الاتجاه الطولي في جدار البطن. استخدام ملقط منحنية لدفع برفق حول جرح مفتوح - وهذا سوف الداخل للظاهر الكلى والسماح لتجميد لطيف من الجهاز قبل الحقن.
   3. تحميل حقنة هاميلتون مع 5 ميكرولتر من خليط الخلية المعدة. لimplan الفرعية المحفظةطفرات، طريقتين زرع يمكن استخدامها:
      1. سطحية: تشغيل بالتوازي مع الموجه طوليا الكلى وإبر إدراج تحت كبسولة الكلى (ولكن فوق حمة) مع مشطوف حافة فوق. مرة واحدة الإبرة في المكان، وضخ كافة الخلايا حتى أشكال فقاعة صغيرة بيضاء. إزالة الإبرة ببطء من كبسولة وصمة عار على الفور على حقن مع القطن يميل قضيب العقيمة لاستيعاب أي تسرب ومنع نشر الخلية.
      2. الداخلية: مع مشطوف الحافة وتصل بدءا من الجانب المعاكس من الكلى إلى موقع غرس النهائي، إدراج الإبرة من خلال الداخلية من الكلى حتى إبرة مرئيا (ولكن ليس ثقب) مساحة شبه المحفظة. حقن كافة الخلايا حتى أشكال فقاعة بيضاء وموقع الحقن مسحة لمنع أي تسرب.
   4. العودة برفق الكلى إلى تجويف الجسم. إغلاق جدار البطن باستخدام امتصاص الجسم 5-0 VICRYL خياطة. مرة واحدة كاملة، وسحب طبقة الجلد معا ووضع 2-3 ثس اوند مقاطع. ضمان مقاطع هي شركة وبالتساوي متباعدة لضمان عدم التعرض الجرح. قبل الانتعاش إدارة 500 ميكرولتر من 0.9٪ كلوريد الصوديوم و 100 ميكرولتر من البوبرينورفين (0.01 ملغ / مل) تحت الجلد باستخدام إبرة G 25. بشكل روتيني رصد مقطع التنسيب والاستقرار، وإزالة بعد 10 يوما.

2. استئصال الكلية / إزالة ورم الابتدائية

1. اتبع بروتوكول متطابقة لتخدير الماوس، الشلل، شق، وتعرض الكلى كما هو موضح في الأقسام 1.2.1 و 1.2.2 (أعلاه).
2. استخدام الزوج الثاني من ملقط لعزل الكلى عن طريق إزالة بلطف الأنسجة الدهنية الاتصال من نهاية الذيلية والغدة الكظرية من نهاية الجمجمة في الكلى. بينما يمسك بلطف الكلى، استخدم امتصاص 5-0 VICRYL خياطة لجعل عقدة مزدوجة حول الحالب، الشريان الكلوي، والوريد. آمنة ببطء ثم قطع فوق عقدة لإزالة الكلى. إذا أي علامة على الفور فقدان الدم، أو كان هناك خطر من الانتظار كافيةمن الدرز على الحالب، الشريان، والوريد، ثم استخدم cauterizer بدلا من المقص لقطع عقدة أعلاه.
3. مرة واحدة تتم إزالة الكلى، والتحقق بعناية لأي نزيف من الشريان تعادل واستخدام cauterizer إذا لزم الأمر. إغلاق جدار الجسم البطن باستخدام 5-0 VICRYL. سحب طبقة الجلد معا ووضع 2-3 مقاطع الجرح نفس الاحتياطات التالية كما هو موضح في 1.2.4. عن كثب رصد حيوان يوميا بعد الجراحة للعلامات الضائقة، والنزيف، أو محدودية الحركة. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية للحيوان بأمان.

3. رصد التقدم النقيلي والتعريب في نقطة النهاية

1. الكمي المرض المنتشر: رصد للإضاءة الحيوية
   1. رؤية منهجية الموصوفة سابقا في JOVE لرصد الانبثاث باستخدام الخلايا transfected مع luciferase المراسل وكميا باستخدام Xenogen IVIS نظام التصوير ^11،12.
2. دليل التشريح البصرية لتقييم مقارن للموزع النقيلينشوئها
   1. تضحية الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية باستخدام نقاط النهاية بما في ذلك علامات الضائقة، صعوبة في التنفس، وفقدان الوزن، الخ
      ملاحظة: الرصد الدقيق للحيوانات أمر بالغ الأهمية كما تقدم النقيلي عفوية يمكن أن تكون متغيرة بصورة كبيرة وسريعة.
   2. استخدام مقص جراحي الشروع في شق مجرى البول أعلاه أن ما يصل يستمر التجويف الصدري إلى انخفاض الفك السفلي. استخدام مقص حادة العضوية لفصل الجلد من العضلات في جدار البطن.
   3. بدء شقوق على طول الذراعين والساقين. قشر الجلد بعيدا. دراسة عن كثب لفافة الجلد وجدار البطن لعقيدات، ثم الغدد الليمفاوية السطحية: الأربية، العضدية، الإبطية والعنقية سطحية.
   4. إجراء شق في جدار البطن وقطع على طول الجانبين الجانبي الأيمن والأيسر حتى الحجاب الحاجز. مع قطع أفقي واحد إزالة الجزء الأمامي من جدار البطن إلى عارية الأحشاء.
   5. دراسة مظهر من دون عائق و الأحشاءأو بشكل صارخ الأورام ملحوظا. نلاحظ أيضا محتويات المعدة والأمعاء؛ إذا كانت فارغة، والماوس قد لا يكون قادرا على تناول الطعام. إذا كانت محتويات مظلمة، وهذا قد يشير إلى أدلة من العلوية / السفلية نزيف الجهاز الهضمي.
   6. بصريا يسجل كل جهاز لوجود ورم أو الغياب، تعيين الدرجة الكلية لكل مجموعة ماوس (4 الحيوانات لكل مجموعة ويستخدم كمثال في الشكل 1D-I).
      ملاحظات: 1) تضخم الغدد الليمفاوية لا يعني بالضرورة أنه هو نمو الورم؛ إذا كان الحجم كبيرا وحازما جدا، ولون بيضاء، فمن المرجح العقيدات المتنقل. 2) الإفراط أو السائل اللبني غائم في البطن يشير الاستسقاء. ويمكن أن تشمل استسقاء التراكمات الصلبة على أعضاء البطن، وخاصة بين فصوص الكبد والمعدة. 3) لأجهزة مثل الرئتين، ويمكن العقيدات متعددة تكون موجودة وعدها لإجراء مقارنات بين الحيوانات الفردية (انظر على سبيل المثال ^13).
   7. تحديد الأورام أو تشوهات جسيمة من أعضاء البطن الفردية: الكبد والطحال والكلى والبنكرياس عن طريق إزالة بعناية والغسيل مع برنامج تلفزيوني من زجاجة بخ.
   8. بعد إزالة أعضاء البطن، وفحص الغدد الليمفاوية في البطن، بما في ذلك الفقرات القطنية، العجزية، الكلوي، والمساريقي العقدة الليمفاوية.
   9. تقييم الحجاب الحاجز عن أدلة على انتشار النقيلي.
      ملاحظة: انتشار واسعة النطاق على الحجاب الحاجز يمكن أن يؤدي إلى فقدان انقباض لها، مما يؤدي إلى صعوبة في التنفس أو فقدان.
   10. إزالة الحجاب الحاجز وجعل اثنين من الشقوق الجانبية في التجويف الصدري، وإزالة الجزء الجبهي لفضح الرئتين والقلب.
   11. إزالة الرئتين والقلب عن طريق استيعاب بلطف ورفع المريء والقصبة الهوائية وقطع فوق القلب. تقييم الأنسجة للالعقيدات. ضغط القلب. عدم الاتساق يقظ قد تشير إلى ورم الحاضر.
   12. استخدام مقص جراحي لخفض خطيا من خلال الجمجمة. بلطف إزالة قطع صغيرة من الجمجمة حتى رما يتعرض له الدماغ كله. ننظر في جميع أنحاء الدماغ لعقيدات مرئية أو تشوهات تغيير الألوان.

النتائج

ويبين الشكل 1A تخطيطي يبين الإجراءات المفصلة في هذا الملخص البروتوكول. يجب النظر في عدة عوامل هامة لكل خطوة. على سبيل المثال، في الخطوة 1 فإنه يدل على طريقتين لشبه المحفظة زرع الخلايا السرطانية في الكلى. الخلايا السرطانية يمكن زرعها في الفضاء دون المحفظة مع ا?...

Discussion

الغرض من هذا البروتوكول هو لتقييم المرض المنتشر عفوية ذات الصلة سريريا باستخدام نموذج الفأر مسانج ورم لوصف تقنيات زرع / بتر. حاليا، فإن غالبية الدراسات قبل السريرية تقييم العلاجات التجريبية الرواية لا تتضمن دراسة المرض المنتشر وعدد قليل فقط ألخص مراحل النمو الأولية...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Trypsin EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-162-35
Pocket pro pet trimmer	Braintree scientific	CLP9931B
Alcohol swab	VWR	326895
Betadine solution swab	VWR	67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"	Southpointe surgical	RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long	Kent scientific	INS15915	need two of these
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7635-01
30 G, 45 degree, RN needle	Hamilton	7803-07
Sterile cotton tipped appicator	VWR	10805-144
High temperature cautery kit	Kent scientific	INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle	Ethicon	J834
Reflex clip applier for 7 mm clips	Kent scientific	INS500343
Reflex clips, 7 mm, non-sterile	Kent scientific	INS500344
Removing forceps, 12 cm long	Kent scientific	INS500347
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorphine 0.01 mg/ml
25 G 5/8" needle	VWR	BD305122
1 ml syringe w/out needle	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G