Modélisation spontanée carcinome rénal métastatique (MRCC) chez des souris après néphrectomie

Résumé

Les modèles de métastases de carcinome à cellules rénales (RCC), la progression de la maladie spontanée peuvent être utilisées pour l'évaluation des traitements dans un cadre clinique. Ce protocole illustre différentes procédures d'implantation orthotopique de cellules de tumeur du rein, une néphrectomie proprement dit, et présente enfin un guide de notation visuelle de l'autopsie et bioluminescent de charge métastatique et de la localisation.

Résumé

L'un des principaux obstacles à l'amélioration de l'essai de nouveaux traitements expérimentaux dans le carcinome à cellules rénales (RCC) est le développement de modèles qui récapitulent fidèlement la progression de la maladie métastatique précoce et à un stade avancé. Des modèles d'implantation de la tumeur typiques utilisent implantation de la tumeur primaire ectopique ou orthotopique, mais peu comprennent la maladie métastatique spontanée systémique qui imite l'environnement clinique. Ce protocole décrit les principales étapes pour développer la progression de la maladie RCC met en scène similaire aux patients. En premier lieu, il utilise une lignée de cellules de tumeur de souris hautement métastatique dans un modèle orthotopique syngénique pour montrer l'implantation des cellules tumorales. Les méthodes comprennent l'implantation superficielle et interne dans l'espace sous-capsulaire avec des cellules associées à matrigel pour éviter les fuites et la propagation rapide. Ensuite, il décrit les procédures pour l'excision de la tumeur portant rein (néphrectomie), les soins de la souris pré-et post-opératoire critique. Enfin, il décrit les étapes nécessaires pour surveiller et évaluermicro-et macro progression de la maladie métastatique, y compris l'imagerie de bioluminescence ainsi fournit un guide détaillé de l'autopsie visuelle de marquer distribution de la maladie systémique. Le but de cette description du protocole est de faciliter l'utilisation généralisée de modèles de CCR métastatiques cliniquement pertinentes pour améliorer la valeur prédictive du test thérapeutique futur.

Introduction

La principale cause de mortalité chez les patients atteints de carcinome à cellules rénales (RCC) est une maladie métastatique systémique qui se produit généralement après l'élimination chirurgicale d'une tumeur primaire de plus en plus dans le rein. Cependant, très peu de modèles précliniques de tumeurs évaluation thérapeutique expérimentale chez la souris incluent la maladie métastatique, et encore moins récapitulent fidèlement les stades cliniques de croissance localisée, la chirurgie et l'initiation et la progression ^1-3 micro-métastatique spontanée. Cet écart dans les tests est devenu de plus en plus important dans l'évaluation de nouvelles thérapies car parfois saisissants effets anti-tumeurs observés chez des modèles animaux ne sont pas toujours traduits dans le traitement similaire de patients avec succès ^4. Ces différences de résultats peuvent provenir d'efficacités de drogue différentiels entre les modèles extra-utérines ou orthotopiques localisées tumeur primaire et à un stade avancé métastatique ^5-7. Dans le cas de RCC, seules quelques études ont établi un employéNimal protocoles qui incluent la maladie récurrente spontanée qui imite les patients qui ont eu généralement reins porteuses de tumeurs retirées totalement ou partiellement ^{de 2,3.} Les raisons de cette pénurie dans les tests de modèle de souris varient. Tout d'abord, il est le coût élevé des animaux et de la variabilité inhérente à la sélection de cellules de tumeur et son potentiel métastatique. Par exemple, des lignées de cellules de rein humain ont tendance à former des métastases rarement, et doivent être choisis sur des cycles multiples de l'implantation primaire orthotopique et sélection métastatique de dériver des variants qui diffusent de manière cohérente et forment des lésions éloignés (voir la description d'un tel dérivé de lignée cellulaire humaine ^8-10) . A l'inverse, des cellules de souris dans des modèles immunocompétents ont tendance à se comporter de manière agressive, et un faible nombre de cellules doivent être injectés avec matrigel à réduire la propagation systémique immédiate ^3. Deuxièmement, des difficultés techniques dans l'exécution de l'implantation proprement dite, la résection chirurgicale (néphrectomie), et suivi (et quantification) metastati spontanéela croissance c peut être difficile et plusieurs variables critiques besoin considération lors de l'utilisation de cette technique (voir discussion pour plus de détails). Le but de ce protocole est de décrire les étapes essentielles (ainsi que les pièges potentiels) d'implantation orthotopique, la résection (néphrectomie), et la surveillance de la maladie spontanée RCC métastatique et d'offrir une ligne directrice pour standardisée (et plus largement) utiliser les laboratoires scientifiques qui évaluent l'efficacité des traitements expérimentaux.

Protocole

1. Orthotopique tumeur du rein Implantation

1. Culture cellulaire
   1. Avant l'implantation orthotopique, cultiver des cellules de souris RENCA ^LUC comme une monocouche à 75% de confluence.
   2. À la suite de traitement à la trypsine et de la remise en suspension dans des milieux contenant du FBS à 5%, les cellules de centrifugation à 1000 tpm, 4 ° C pendant 5 minutes, en répétant trois fois pour laver dans du PBS. Puis remettre en suspension les cellules dans des milieux sans sérum à une concentration de 5 x 10 ⁴ RENCA ^LUC / 5 médias sans sérum ul.
      Remarque: Selon la variante ou lignée cellulaire utilisée, les cellules peuvent être remises en suspension dans un rapport de 1:1 de matrigel et des milieux sans sérum pour ralentir la croissance très agressif de cellules de souris et de la diffusion après l'implantation.
2. Chirurgie et cellule implantation
   Remarque: Toutes les études animales qui y sont décrits, y compris l'entretien et la détermination des paramètres expérimentaux, ont été réalisées selon le Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnels (IACUC) protocol approuvé par Roswell Park Cancer Institute.
   1. Anesthésier une souris Balb / C en utilisant l'isoflurane (2-3%). Pincez pied et vérifier réflexe pour assurer une anesthésie suffisante. Appliquer vétérinaire pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement. Placez la souris en décubitus latéral droit et gauche se raser entre avant et des membres postérieurs. Appliquer de l'alcool et de l'iode long dorsal région lombaire pour préparer de façon aseptique zone pour l'incision.
   2. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour lancer une incision cutanée de 1 cm dans une direction longitudinale entre la dernière côte et la hanche. Desserrer tissu conjonctif sous la peau à l'aide d'un ciseau dissection émoussée. Utiliser des ciseaux chirurgicaux pour effectuer une incision de 0,5 cm dans une direction longitudinale dans la paroi abdominale. Utilisez une pince courbes pour pousser doucement vers le bas autour plaie ouverte - ce sera d'extérioriser les reins et permettre l'immobilisation douce d'organes avant l'injection.
   3. Charger la seringue Hamilton avec 5 pl du mélange de cellules préparé. Pour implan sous-capsulairestions, deux méthodes d'implantation peuvent être utilisés:
      1. Superficiel: Parallèlement à l'rein, l'aiguille d'insertion orientée longitudinalement sous la capsule rénale (mais au-dessus du parenchyme) avec le bord biseauté vers le haut. Une fois l'aiguille est en place, injecter toutes les cellules jusqu'à ce que de petites formes de bulles blanches. Retirer lentement l'aiguille de la capsule et éponger immédiatement à l'injection avec un coton applicateur incliné stérile pour absorber toute fuite et empêcher la diffusion cellulaire.
      2. Interne: Avec bord biseauté vers le haut et à partir du côté opposé de rein finale de site d'implantation, à insérer l'aiguille à travers l'intérieur du rein jusqu'à ce que l'aiguille est visible (pas de perforation) l'espace sous-capsulaire. Injecter toutes les cellules jusqu'à ce que les formes de bulles blanches et écouvillon site d'injection pour éviter toute fuite.
   4. Retourner doucement le rein à la cavité du corps. Fermez la paroi abdominale du corps en utilisant résorbable Vicryl 5-0. Une fois terminé, retirez la couche de peau ensemble et placer 2-3 wplaies clips. S'assurer que les attaches sont fermes et régulièrement espacées afin de s'assurer qu'aucun exposition de la plaie. Avant d'administrer le recouvrement 500 ul de NaCl à 0,9% et 100 ul de la buprénorphine (0,01 mg / ml) par voie sous cutanée au moyen d'une aiguille G 25. Surveiller régulièrement le placement et la stabilité clip et retirer après 10 jours.

2. Néphrectomie / ablation de la tumeur primaire

1. Suivez protocole identique pour l'anesthésie de la souris, l'immobilisation, l'incision, et l'exposition de rein comme décrit dans les sections 1.2.1 et 1.2.2 (ci-dessus).
2. Utiliser une deuxième paire de pinces d'isoler les reins en retirant doucement le tissu adipeux de liaison à partir de l'extrémité caudale et la glande surrénale de l'extrémité crânienne du rein. Tout en saisissant doucement le rein, utilisez résorbable Vicryl 5-0 pour faire un double noeud autour de l'uretère, l'artère rénale, et la veine. Lentement sécurisé puis couper au-dessus du nœud à retirer le rein. Si aucun signe de perte de sang immédiatement, ou il ya un risque de prise insuffisantede suture sur l'uretère, l'artère et la veine, puis utilisez cauterizer au lieu de ciseaux pour couper au-dessus noeud.
3. Une fois le rein est retiré, vérifiez soigneusement pour des saignements de l'artère liée et utiliser cauterizer si nécessaire. Fermez la paroi abdominale du corps en utilisant 5-0 Vicryl. Tirez la couche de peau ensemble et placer 2-3 des agrafes suivant mêmes précautions que décrit dans 1.2.4. Suivre de près l'animal tous les jours après la chirurgie pour des signes de détresse, des saignements ou à mobilité réduite. Suivez les directives institutionnelles pour animaux en toute sécurité.

3. Surveillance métastatique Progression et localisation à Endpoint

1. Quantification de la maladie métastatique: surveillance bioluminescentes
   1. Voir méthode décrite précédemment dans JOVE pour surveiller les métastases en utilisant des cellules transfectées avec la luciférase et quantifiés à l'aide du système d'imagerie IVIS ^11,12 Xenogen.
2. Guide visuel de l'autopsie d'évaluation comparative de la distribution métastatiquetion
   1. Sacrifier des animaux selon les directives institutionnelles en utilisant des paramètres, y compris des signes de détresse, respiration laborieuse, perte de poids, etc
      Remarque: Une surveillance étroite des animaux est essentiel que la progression métastatique spontanée peut être très variable et rapide.
   2. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour lancer une incision au-dessus de l'urètre qui se poursuit jusqu'à la cavité thoracique de la mandibule inférieure. Utilisez des ciseaux à bouts francs à séparer la peau du muscle de la paroi abdominale.
   3. Initier incisions le long bras et les jambes. Peel peau loin. Examiner de près l'aponévrose de la peau et la paroi abdominale des nodules, puis les ganglions lymphatiques superficiels: inguinal, brachial, axillaires et cervicales superficielle.
   4. Faire une incision dans la paroi abdominale et couper le long des côtés latéraux gauche et droit jusqu'à la membrane. Avec une coupe horizontale enlever la partie avant de la paroi abdominale pour mettre à nu les viscères.
   5. Examiner l'aspect intact des viscères fou grossièrement tumeurs notables. A noter également le contenu de l'estomac et des intestins; si elles sont vides, la souris peut ne pas avoir été capable de manger. Si le contenu est sombre, cela peut indiquer une hémorragie supérieure / inférieure gastro-intestinal.
   6. Marquer visuellement chaque organe de la présence ou de l'absence de la tumeur, l'attribution d'un score total pour chaque groupe de souris (quatre animaux par groupe est utilisé comme exemple dans la figure 1D-i).
      Notes: 1) l'élargissement des ganglions lymphatiques ne signifie pas nécessairement qu'il s'agit d'une croissance de la tumeur; si elle est grandement taille, très ferme, et une couleur blanchâtre, il est probable un nodule métastatique. 2) laiteux excessive ou liquide trouble dans l'abdomen indique ascite. L'ascite peuvent inclure des accumulations de solides sur les organes abdominaux, en particulier entre les lobes du foie et de l'estomac. 3) pour des organes tels que les poumons, de multiples nodules peuvent être présents et compté pour les comparaisons entre les animaux (voir ¹³ par exemple).
   7. Identifier des tumeurs ou des anomalies flagrantes des organes abdominaux individuels: foie, la rate, les reins et le pancréas par soigneusement enlever et laver avec du PBS d'un vaporisateur.
   8. Après avoir retiré les organes abdominaux, inspecter les ganglions lymphatiques abdominaux, y compris la région lombaire, sacrale, rénal, et le ganglion lymphatique mésentérique.
   9. Évaluer diaphragme pour preuve de la dissémination métastatique.
      Remarque: propager largement sur ​​la membrane peut lui faire perdre sa contractilité, conduisant à travaillé ou perte de la respiration.
   10. Retirer la membrane et faire deux incisions latérales dans la cavité thoracique, retirer la partie frontale pour exposer les poumons et le cœur.
   11. Retirer les poumons et le cœur en saisissant délicatement et en soulevant l'œsophage et la trachée coupe au-dessus du cœur. Évaluer les tissus des nodules. Pressez coeur. Manque de cohérence élastique peut indiquer une tumeur présente.
   12. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper linéairement par crâne. Retirez délicatement les petits morceaux de crâne jusqu'à ce que til tout le cerveau est exposé. Rechercher dans tout le cerveau des nodules visibles ou des anomalies des décolorations.

Résultats

La figure 1A montre un schéma décrivant les procédures décrites dans ce résumé du protocole. Plusieurs facteurs importants doivent être pris en considération à chaque étape. Par exemple, dans l'étape 1, on montre deux méthodes pour l'implantation des cellules tumorales sous-capsulaire dans le rein. Les cellules tumorales peuvent être implantés dans l'espace sous-capsulaire avec un petit blanc-bulle confirmant le placement localisée des cellules avec fuite empêché par l'?...

Discussion

Le but de ce protocole est d'évaluer la maladie métastatique spontanée cliniquement pertinente en utilisant un modèle de souris de tumeur syngénique à décrire les techniques d'implantation / de résection. Actuellement, la majorité des études précliniques évaluant de nouveaux traitements expérimentaux ne comprend pas l'étude de la maladie métastatique et seulement quelques-uns récapituler les étapes de la croissance de la tumeur primaire, la résection chirurgicale, et une éventuelle dissém...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Trypsin EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-162-35
Pocket pro pet trimmer	Braintree scientific	CLP9931B
Alcohol swab	VWR	326895
Betadine solution swab	VWR	67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"	Southpointe surgical	RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long	Kent scientific	INS15915	need two of these
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7635-01
30 G, 45 degree, RN needle	Hamilton	7803-07
Sterile cotton tipped appicator	VWR	10805-144
High temperature cautery kit	Kent scientific	INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle	Ethicon	J834
Reflex clip applier for 7 mm clips	Kent scientific	INS500343
Reflex clips, 7 mm, non-sterile	Kent scientific	INS500344
Removing forceps, 12 cm long	Kent scientific	INS500347
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorphine 0.01 mg/ml
25 G 5/8" needle	VWR	BD305122
1 ml syringe w/out needle	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G