마우스의 자발적인 전이성 신장 세포 암 (mRCC)를 모델링에 따라 신장 절제술

요약

자발 전이성 신장 세포 암종 (RCC) 질병 진행의 모델은 관련 임상 설정에서 치료를 평가하는 데 사용될 수있다. 이 프로토콜은 동소 신장 종양 세포 주입, 적절한 절제를위한 다른 절차를 설명하고, 마지막으로 전이성 부담 및 현지화의 시각 및 생물 발광 점수에 대한 부검 가이드를 간략하게 설명합니다.

초록

신장 세포 암 (RCC)에 새로운 실험 치료학의 향상 테스트의 핵심 과제 중 하나는 충실 초기와 말기 전이성 질환의 진행을 요점을 되풀이 모델의 개발이다. 일반적인 종양 이식 모델은 자궁외 또는 소성을 기본 종양 주입을 사용하지만, 몇 가지 임상을 모방 전신 자연 전이성 질환이 (가) 있습니다. 이 프로토콜은 RCC의 질병의 진행은 환자와 유사한 스테이지 개발하는 주요 단계를 설명합니다. 첫째, 동소 종양 세포 주입을 보여 동계 모델 높게 전이성 마우스 종양 세포주를 사용한다. 방법 누출 및 조기 확산을 방지하기 위해 리겔과 함께 세포와 하위 캡슐 공간으로 표면 및 내부 주입이 (가) 있습니다. 다음은 중요한 사전 및 사후 수술 마우스주의, 종양 베어링 신장 (신장 절제술)의 절단에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 그것은 모니터링 및 평가하는 데 필요한 단계를 설명마이크로뿐만 아니라 발광 생물 이미징을 포함하여 매크로 전이성 질병의 진행은, 전신 질환 분포를 점수에 대한 자세한 시각적 부검의 가이드를 제공합니다. 프로토콜이 설명의 목적은 미래의 치료 시험의 예측값을 개선하기 위해 임상 적 전이성 RCC 모델의 광범위한 사용을 용이하게하는 것이다.

서문

신장 세포 암 (RCC) 환자에서 사망의 주요 원인은 일반적으로 신장에서 성장하는 차 종양 제거 수술을 다음 발생 전신 전이성 질환이다. 그러나 생쥐의 실험적인 치료를 평가하는 거의 임상 종양 모델은 전이성 질환을 포함, 적은 여전히 충실하게 현지화 성장, 수술, 그리고 자연 미세 전이 개시 및 진행 ^1-3의 임상 단계를 요점을 되풀이하다. 테스트에서이 차이는 때때로 동물 모델에서 볼 눈에 띄는 항 종양 효과는 항상 환자 ⁴ 유사 성공적인 치료로 번역되지 않은 새로운 치료법의 평가에서 점점 중요 해지고있다. 결과에 이러한 차이는 지역화 자궁외 또는 소성을 기본 종양 모델과 말기 전이성 질환 ^5-7 사이의 차이 약물 효능에서 줄기 수 있습니다. RCC의 경우에는, 단지 몇 가지 연구가 확립 채용했다일반적으로 종양 베어링 신장 있었다 모방 환자가 전체 또는 부분적으로 ^2,3를 제거 자연 재발이 포함 nimal 프로토콜. 마우스 모델 시험이 부족에 대한 이유는 다양합니다. 첫째, 높은 동물의 비용과 종양 세포의 선택 및 전이성 잠재력을 내재 변동성이있다. (예 : 인간 세포주 유도 ^8-10의 설명 참조) 예를 들어, 사람의 신장 세포주 거의 전이되지 경향이 있고, 소성을 기본 착상 일관 보급 먼 병변을 형성 변이체를 유도 전이성 선택의 여러 라운드를 통해 선택해야 . 반대로, 면역 모델에서 마우스 세포 공격적 행동 경향이 있고, 저 세포 수는 즉각적인 조직 확산 ^3을 줄이기 매트 리겔로 주입되어야한다. 둘째, 기술 적절한 주입, 수술 적 절제 (절제)을 수행하고, 추적의 어려움 (및 정량화) 자연 metastatiC의 성장은 도전 일 수있다 (자세한 내용은 설명을 참조)이 기술을 사용하면 몇 가지 중요한 변수는 고려가 필요합니다. 이 프로토콜의 목적은 소성을 주입, 절제 (절제), 그리고 자연 전이성 신 세포 암 질환의 감시의 필수 단계 (뿐만 아니라 잠재적 인 함정)를 설명하는 표준화 된 (그리고 널리 보급)에 대한 가이드 라인을 제공하기 위해 과학 실험실 사이에 사용합니다 그 실험적인 치료의 효능을 평가합니다.

프로토콜

1. 동소 신장 종양 이식

1. 세포 배양
   1. 이전 동소 이식에 75 %의 포화 상태에 단층으로 마우스 RENCA ^{LUC 세포를} 성장.
   2. 5 % FBS 함유 미디어, 1,000 rpm에서 원심 분리기 세포, 5 분 동안 4 ° C, PBS에 세척을 3 회 반복의 트립신 처리 및 재 부유 다음과 같습니다. 그런 다음 5 × ⁴ RENCA ^LUC / 5 μL의 혈청이없는 미디어의 농도로 혈청이없는 배지에서 세포를 재현 탁.
      참고 : 변형 또는 사용되는 세포주에 따라 세포가 주입 후 매우 공격적인 마우스 세포의 성장과 보급을 느리게하는 리겔 혈청 무료 매체의 1:1 비율로 재현 탁 할 수있다.
2. 수술과 세포 이식
   참고 : 모든 동물 연구 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) P에 따라 수행 된 실험 엔드 포인트의 유지 보수 및 결정을 포함하여 여기서 설명rotocol 로스웰 파크 암 연구소의 승인을.
   1. 아이소 플루 란 (2-3 %)을 사용하여 하나의 Balb / C 마우스를 마취. 발을 조이고 충분한 마취를 보장하기 위해 반사를 확인합니다. 건조를 막기 위해 눈에 수의사 연고를 적용합니다. 오른쪽 측면 드러 누움에 마우스를 놓고 앞과 뒷다리 사지 사이에 왼쪽을 면도. 무균 적으로 절개에 대한 영역을 준비하는 등의 요추 영역에 따라 알코올과 요오드를 적용합니다.
   2. 마지막 리브 및 고관절과 길이 방향으로 1cm의 피부 절개를 시작하는 외과 용 가위를 사용한다. 무딘 해부 가위를 사용하여 피부 아래의 결합 조직을 풉니 다. 복벽에서 길이 방향으로 0.5 cm 절개를 만들기 위해 수술 가위를 사용한다. 살짝 열려있는 상처 주위에 아래로 밀어 곡선 집게를 사용 -이 신장을 외면 화하다 전에 주입 기관의 부드러운 고정화 수 있습니다.
   3. 제조 된 세포 혼합물 μL 5와 해밀턴 주사기를 넣습니다. 서브 캡슐 IMPLAN에 대한테이션은,이 주입 방법이 사용될 수있다 :
      1. 표면 : 경 사진 가장자리쪽으로 신장 캡슐 아래의 길이 방향으로 지향 신장, 삽입 바늘 (그러나 실질 위) 병렬 실행. 바늘이 제자리에 있으면, 작은 흰색 거품이 형성 될 때까지의 모든 셀을 주입. 천천히 캡슐에서 바늘을 제거하고 즉시 유출을 흡수하고 세포의 확산을 방지하기 위해 멸균 면봉으로 주입에 얼룩.
      2. 내부 : 바늘이 눈에 보이는 (하지만 천공하지) 때까지 경 사진 가장자리까지 최종 주입 사이트에 신장 반대의 측면에서 시작으로, 신장의 내부를 서브 캡슐 공간 바늘을 삽입합니다. 흰색 거품 형태 및 면봉 주사 부위가 새는 것을 방지 할 때까지의 모든 셀을 주입.
   4. 부드럽게 체강에 신장을 반환합니다. 흡수 5-0 Vicryl 봉합사를 사용하여 복부 신체의 벽을 닫습니다. 완료되면, 함께 피부 층을 끌어 승 2 ~ 3 배치클립을 ound. 확인 클립은 확고하고 균등하게 더 상처의 노출을 지키기 위하여 이격되어있다. 이전 복구에 0.9 %의 NaCl 500 ㎕를 피하 25 G 바늘을 사용하여 프레 놀핀 (0.01 ㎎ / ㎖)의 100 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. 정기적으로 클립의 위치와 안정성을 모니터링하고, 10 일 이후 제거합니다.

2. 신장 절제술 / 차 종양 제거

1. 섹션 (위) 1.2.1과 1.2.2에서 설명한대로 마우스 마취, 고정, 절개, 신장의 노출에 대한 동일한 프로토콜을 따르십시오.
2. 부드럽게 꼬리 끝에서 연결하는 지방 조직과 신장의 두개골 끝에서 부신을 제거하여 신장을 분리 포셉의 두 번째 쌍을 사용합니다. 부드럽게 신장을 잡을 경우, 요관 주위에 두 배 매듭, 신장 동맥 및 정맥을 만들기 위해 흡수 5-0 Vicryl 봉합사를 사용합니다. 천천히 안전하고 신장을 제거하는 매듭 위에 잘라. 바로 혈액 손실, 또는이의 흔적이 부족 보류의 위험이있는 경우요관, 동맥 및 정맥에 봉합하고 매듭 위에 잘라 대신 가위를 cauterizer를 사용합니다.
3. 신장이 제거되면, 연결 동맥에서 출혈에 대해주의 깊게 확인하고 필요한 경우 cauterizer를 사용합니다. 5-0 Vicryl을 사용하여 복부 신체의 벽을 닫습니다. 함께 피부 층을 당겨 1.2.4에 설명 된대로 같은주의 사항을 다음 2-3 상처 클립을 배치합니다. 밀접하게 출혈 고통의 흔적, 또는 제한된 이동성을위한 수술 후 매일 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 안전하게 동물에 대한 제도적 지침을 따르십시오.

3. 엔드 포인트에서의 전이성 진행 상황 및 지역화를 모니터링

1. 전이성 질병 정량화 : 바이오 루미 네 센트 모니터링
   1. 이전 루시퍼 라제 형질 세포를 사용하여 전이를 모니터링하고 Xenogen IVIS 이미징 시스템 ^{(11, 12)를} 사용하여 정량을 위해 정돈에 기재된 방법을 참조.
2. 전이성 분포의 비교 평가를위한 시각적 부검 가이드기
   1. 등의 증세, 호흡 곤란, 체중 감소, 등의 엔드 포인트를 사용하여 기관의 지침에 따라 동물을 희생
      참고 : 자연 전이성 진행이 매우 다양하고 신속한 될 수있는 동물의 근접 모니터링이 중요합니다.
   2. 낮은 하악골에 흉강을 계속 요도 위의 절개를 시작하기 위해 외과 용 가위를 사용합니다. 복부 벽의 근육으로부터 피부를 분리하는 무딘 종단 가위를 사용합니다.
   3. 팔과 다리를 따라 절개를 시작합니다. 껍질 피부 떨어져. 밀접하게 피부 근막과 결절 복부 벽을 검토 한 후 표면 림프절 : 사타구니, 상완, 겨드랑이와 피상적 인 자궁.
   4. 복벽에 절개를하여 격막까지 왼쪽과 오른쪽 측면을 따라 잘라. 하나의 수평 잘라 내장을 베어 복부 벽의 앞 부분을 제거합니다.
   5. 내장 f를 그대로 모양을 검사또는 크게 주목할만한 종양. 또한 위장의 내용을 참고; 비어있는 경우, 마우스를 먹을 수있게되지 않았을 수 있습니다. 내용이 어두우면,이 상부 / 하부 위장관 출혈의 증거를 나타낼 수 있습니다.
   6. 시각적으로 각 마우스 그룹의 총 점수를 할당, 종양의 존재 여부에 대한 각 기관의 점수 (그룹 당 4 동물 그림 1D-I에서 예제로 사용).
      주 1) : 림프절의 확대는 반드시이 종양의 성장을 의미하지는 않는다; 그것은 크게 크기의 아주 확고 흰 색 경우, 그것은 가능성이 전이성 결절이다. 2) 복부에 과도한 우유 또는 흐린 액체가 복수를 나타냅니다. 복수는 특히 간장과 위장의 엽 (叶) 사이의 복부 장기에 고체 축적을 포함 할 수있다. 3) 같은 폐 등의 장기를 들어, 여러 결절 (예를 들어 ¹³ 참조) 현재와 개별 동물 사이의 비교에 대해 계산 될 수 있습니다.
   7. 신중하게 물총 병에서 제거하고 PBS로 세척하여 간, 비장, 신장, 췌장 : 개별 복부 장기의 심​​한 종양 또는 이상을 확인합니다.
   8. 복부 장기를 제거한 후, 요추, 천골, 신장, 및 장간막 림프절 등 복부 림프절을 검사한다.
   9. 전이성 확산의 증거를 다이어프램을 평가합니다.
      참고 : 다이어프램에 광범위한 확산이 고심한 흔적 또는 호흡의 손실로 이어지는, 그것의 수축력을 잃게 될 수 있습니다.
   10. 다이아 프램을 제거하고 폐와 심장을 노출하는 전두엽 부분을 제거, 흉강 두 측면 절개를합니다.
   11. 부드럽게 잡고 들어 올려 식도와 심장 위의 기관을 절단하여 폐와 심장을 제거합니다. 결절에 대한 조직을 평가합니다. 마음을 꽉 잡고. 탄력 일관성의 부족은 종양의 존재를 나타낼 수 있습니다.
   12. 두개골을 통해 선형으로 절단하는 수술 가위를 사용합니다. 부드럽게 t까지 두개의 작은 조각을 제거그는 뇌 전체가 노출됩니다. 눈에 보이는 결절 또는 이상 색소 침착에 대한 뇌 전반에 걸쳐 봐.

결과

그림 1A는이 프로토콜의 개요에 설명 된 절차를 요약 한 회로도를 보여줍니다. 몇 가지 중요한 요인은 각 단계에 대한 고려되어야한다. 예를 들어, 단계 1에서 그 신장에 서브 캡슐 종양 세포 이식을위한 두 가지 방법을 도시한다. 종양 세포는 바늘의주의 제거와 보라고 초과 탈출 유체 (그림 1B-I)에 의해 방지 누설 세포의 지역화 된 위치를 확인하는 작은 흰색 거품과 서브...

토론

이 프로토콜의 목적은 주입 / 절제 기술을 설명하기 위해 동계 종양 마우스 모델을 이용하여 임상 관련 자발적 전이성 질환을 평가하는 것이다. 현재, 새로운 실험적인 치료를 평가하는 전임상 연구의 대부분은 전이성 질환의 연구에 포함되지 않습니다 만 몇 가지 기본 종양의 성장, 수술 적 절제, 그리고 궁극적으로 자연 전이성 확산의 단계를 요점을 되풀이하다. 지금까지 유전자 조작 마우스 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Trypsin EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-162-35
Pocket pro pet trimmer	Braintree scientific	CLP9931B
Alcohol swab	VWR	326895
Betadine solution swab	VWR	67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"	Southpointe surgical	RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long	Kent scientific	INS15915	need two of these
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7635-01
30 G, 45 degree, RN needle	Hamilton	7803-07
Sterile cotton tipped appicator	VWR	10805-144
High temperature cautery kit	Kent scientific	INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle	Ethicon	J834
Reflex clip applier for 7 mm clips	Kent scientific	INS500343
Reflex clips, 7 mm, non-sterile	Kent scientific	INS500344
Removing forceps, 12 cm long	Kent scientific	INS500347
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorphine 0.01 mg/ml
25 G 5/8" needle	VWR	BD305122
1 ml syringe w/out needle	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G