Modelagem espontânea metastático carcinoma de células renais (mRCC) em ratos após nefrectomia

Resumo

Todos os modelos de metástase espontânea do carcinoma de células renais (RCC), a progressão da doença podem ser utilizados para avaliar os tratamentos em um ambiente clinicamente relevante. Este protocolo demonstra procedimentos diferentes para a implantação de células tumorais renal ortotópico, nefrectomia adequada, e, finalmente, apresenta um guia de necropsia para avaliação visual e bioluminescente de carga metastático e localização.

Resumo

Um dos desafios chave para melhorar o teste de novas terapias experimentais em carcinoma de células renais (CCR) é o desenvolvimento de modelos que recapitulam fielmente evolução precoce e tardia da fase da doença metastática. Modelos de implantação do tumor típicos utilizar implantação do tumor primário ectópica ou ortotópico, mas poucos incluem doença metastática espontânea sistêmica que imita o ambiente clínico. Este protocolo descreve os principais passos para desenvolver RCC progressão da doença estágios semelhantes aos pacientes. Primeiro, ela usa um mouse linha de células tumorais altamente metastático em um modelo singênico para mostrar a implantação de células tumorais ortotópico. Os métodos incluem a implantação superficial e interna para o espaço sub-capsular com células combinadas com matrigel a evitar fugas e disseminação precoce. Em seguida, ele descreve os procedimentos para a excisão do rolamento de tumor de rim (nefrectomia), com crítica cuidados pré e pós-cirúrgico mouse. Finalmente, descreve as etapas necessárias para monitorar e avaliarmicro e macro-evolução da doença metastática, incluindo a imagem de bioluminescência também fornece um guia de necropsia visual detalhada para marcar distribuição da doença sistêmica. O objetivo desta descrição protocolo é facilitar o uso generalizado de modelos RCC metastático clinicamente relevantes para melhorar o valor preditivo do futuro teste terapêutico.

Introdução

A causa principal de mortalidade em pacientes com carcinoma de células renais (RCC) é a doença metastática sistémica que ocorre normalmente depois da remoção cirúrgica de um tumor primário em crescimento nos rins. No entanto, muito poucos modelos de tumores pré-clínicos que avaliaram terapêutica experimental em ratos incluem doença metastática, e menos ainda recapitular fielmente os estágios clínicos de crescimento localizado, cirurgia e iniciação micro-metástases espontânea e progressão ^1-3. Esta diferença nos testes tornou-se cada vez mais importante na avaliação de novas terapias como às vezes impressionantes efeitos anti-tumorais observados em modelos animais nem sempre traduzidos para o tratamento da mesma forma bem-sucedida de pacientes ^4. Tais diferenças nos resultados pode decorrer de eficácias de drogas diferenciais entre os modelos de tumor localizado ectópica ou ortotópico primárias e em estágio final de doença metastática ^5-7. No caso da RCC, poucos estudos têm empregado estabeleceu umnimal protocolos que incluem a doença recorrente espontânea que imita os pacientes que têm, tipicamente, tinham rins portadores de tumor total ou parcialmente removidos ^{de 2,3.} As razões para essa falta de testes de modelo de rato variar. Em primeiro lugar, há o custo elevado dos animais e variabilidade inerente de selecção de células de tumor e o potencial metastático. Por exemplo, as linhas de células renais humanas tendem a raramente metástase, e devem ser selecionados ao longo de várias rodadas de implantação primário ortotópico e seleção metastático para derivar variantes que sempre divulgar e formam lesões distantes (ver descrição de tal linha celular uma derivação humana ^8-10) . Por outro lado, células de ratos em modelos imunocompetentes tendem a se comportar de forma agressiva, e os números de celulares de baixa deve ser injetado com matrigel para reduzir a disseminação sistêmica imediato ^3. Em segundo lugar, as dificuldades técnicas na realização de implantação adequada, a ressecção cirúrgica (nefrectomia) e rastreamento (e quantificação) metastati espontâneac crescimento pode ser desafiador e várias variáveis ​​críticas precisam de consideração quando se emprega essa técnica (veja a discussão para mais detalhes). O objectivo deste protocolo é o de descrever os passos essenciais (bem como armadilhas potenciais) de implantação ortotópico, a ressecção (nefrectomia), e monitoramento da doença RCC metastático espontânea e para oferecer uma orientação para padronizada (e mais generalizada) use entre laboratórios científicos que avaliar a eficácia de terapêuticas experimentais.

Protocolo

1. Rim ortotópico Implantação do Tumor

1. Cultura de Células
   1. Antes da implantação ortotópico, cultivar células do rato RENCA ^LUC como uma monocamada a 75% de confluência.
   2. Seguindo tripsinização e re-suspensão em 5% de FBS contendo meio, as células de centrifugação a 1.000 rpm, 4 ° C durante 5 minutos, repetindo três vezes para lavar em PBS. Em seguida, voltar a suspender as células em meio isento de soro para uma concentração de 5 x 10 ⁴ RENCA ^LUC / 5 meios livres de soro ul.
      Nota: Dependendo da variante, ou linha celular utilizada, as células podem ser ressuspendidas numa proporção de matrigel e meio livre de soro de 1:1 a retardar o crescimento de células do rato altamente agressivo e difusão após a implantação.
2. Cirurgia e implantação de células
   Nota: Todos os estudos com animais aqui descritos, incluindo a manutenção e determinação de terminais experimentais, foram realizados de acordo com um Comitê Animal Care e Use Institucional (IACUC) protocolo aprovado pelo Roswell Park Cancer Institute.
   1. Anestesiar um rato Balb / C utilizando isoflurano (2-3%). Aperte o pé e verificar se há reflexo para garantir anesthetization suficiente. Aplicar veterinário pomada para os olhos para evitar a secagem. Coloque o mouse em decúbito lateral direito e fazer a barba do lado esquerdo entre fore-e traseiras-membro. Aplicar álcool e iodo ao longo da área dorsal lombar para preparar assepticamente área de incisão.
   2. Use uma tesoura cirúrgica para iniciar uma incisão de pele um centímetro no sentido longitudinal entre a última costela ea articulação do quadril. Solte o tecido conjuntivo sob a pele usando uma tesoura de dissecção romba. Use tesouras cirúrgicas para fazer incisão de 0,5 cm na direcção longitudinal na parede abdominal. Use uma pinça curva para empurrar suavemente para baixo em torno de ferida aberta - isso vai exteriorizar o rim e permitem a imobilização suave do órgão antes da injeção.
   3. Coloque a seringa de Hamilton com 5 uL da mistura de células preparada. Para implante sub-capsularesções, dois métodos de implantação podem ser empregados:
      1. Superficial: Em paralelo com o rim, a agulha de inserção orientada longitudinalmente sob a cápsula renal (mas acima do parênquima) com a borda chanfrada para cima. Uma vez que a agulha está no lugar, injetar todas as células, até formas pequenas bolhas brancas. Lentamente, retire a agulha da cápsula e apagar imediatamente sobre injeção com um algodão aplicador derrubado estéril para absorver qualquer vazamento e evitar a disseminação de células.
      2. Interno: Com borda chanfrada para cima e a partir do lado oposto do rim definitivo ao local de implantação, inserir a agulha através do interior do rim, até agulha é visível (mas não perfurar) o espaço sub-capsular. Injetar todas as células, até formas de bolhas brancas e local da injeção cotonete para evitar fugas.
   4. Suavemente retornar o rim para a cavidade do corpo. Feche a parede abdominal do corpo usando sutura absorvível 5-0 Vicryl. Uma vez completo, puxar a camada de pele em conjunto e colocar 2-3 wound clips. Assegurar clips são firmes e uniformemente espaçados para garantir que não haja exposição ferida. Antes de se administrar a recuperação de 500 ul de NaCl a 0,9% e 100 ul de buprenorfina (0,01 mg / mL) por via subcutânea utilizando uma agulha G 25. Rotineiramente monitorar colocação clipe e estabilidade, e retire depois de 10 dias.

2. Nephrectomy / remoção do tumor primário

1. Siga o protocolo idêntico para anesthetization mouse, imobilização, incisão e exposição do rim, conforme descrito nas seções 1.2.1 e 1.2.2 (acima).
2. Usar um segundo par de fórceps para isolar o rim suavemente a remoção do tecido de gordura de ligação da extremidade caudal e da glândula supra-renal a partir da extremidade craniana do rim. Ao segurar delicadamente o rim, use absorvível sutura Vicryl 5-0 para fazer um nó duplo ao redor do ureter, artéria renal e veia. Lentamente, seguro e, em seguida, cortada por cima do nó para remover o rim. Se qualquer sinal de perda de sangue imediatamente, ou se houver um risco de retenção insuficientede sutura no ureter, artéria e veia, então use cauterizador em vez de tesoura para cortar acima nó.
3. Uma vez rim é removido, verifique cuidadosamente para qualquer sangramento da artéria amarrado e usar cauterizador se necessário. Feche a parede abdominal do corpo usando Vicryl 5-0. Puxe a camada de pele em conjunto e colocar 2-3 clips ferida após mesmas precauções, conforme descrito no 1.2.4. Acompanhar de perto animais diariamente após cirurgia para sinais de sofrimento, sangramento, ou mobilidade limitada. Siga as orientações institucionais para animais com segurança.

3. Monitoramento metastático Progressão e localização em Endpoint

1. Quantificação doença metastática: monitoramento Bioluminescent
   1. Ver metodologia previamente descrita na JOVE para monitorar metástase usando células transfectadas com luciferase e quantificados utilizando o sistema de imagem ^11,12 Xenogen IVIS.
2. Guia Visual necropsia para avaliação comparativa de distribuição metastáticoção
   1. Sacrificar animais de acordo com as diretrizes institucionais, utilizando endpoints, incluindo sinais de angústia, dificuldade para respirar, perda de peso, etc
      Nota: Fechar o monitoramento de animais é fundamental como progressão metastática espontânea pode ser altamente variável e rápida.
   2. Use uma tesoura cirúrgica para iniciar uma incisão acima da uretra, que continua até a cavidade torácica a mandíbula inferior. Use uma tesoura sem corte-ended para separar a pele do músculo da parede abdominal.
   3. Iniciado incisões ao longo dos braços e pernas. Peel pele de distância. Examine cuidadosamente a pele e fáscia da parede abdominal para nódulos, em seguida, os linfonodos superficiais: inguinal, braquial, axilar e cervical superficial.
   4. Faça uma incisão na parede abdominal e corte ao longo das laterais esquerda e direita, até o diafragma. Com um corte horizontal remover a parte frontal da parede abdominal a nu as vísceras.
   5. Examine a aparência imperturbável das vísceras fou grosseiramente tumores notáveis. Além disso, note o conteúdo do estômago e dos intestinos; se eles estão vazios, o rato pode não ter sido capaz de comer. Se o conteúdo for escuro, isto pode indicar evidência de hemorragia gastrointestinal superior / inferior.
   6. Visualmente marcar cada órgão para a presença ou ausência de tumor, a atribuição de uma pontuação total para cada grupo de rato (4 animais por grupo é usado como exemplo na Figura 1D-i).
      Notas: 1) alargamento dos gânglios linfáticos, não significa necessariamente que é um crescimento do tumor; se é muito porte, muito firme, e uma cor esbranquiçada, é provável um nódulo metastático. 2) leitoso excessivo ou líquido turvo no abdômen indica ascite. Ascite podem incluir sólidos acumulações nos órgãos abdominais, particularmente entre os lóbulos do fígado e do estômago. 3) para os órgãos, tais como os pulmões, nódulos múltiplos podem estar presentes e contadas para comparações entre animais individuais (ver ^13, por exemplo).
   7. Identificar tumores brutas ou anormalidades dos órgãos abdominais individuais: fígado, baço, rins e pâncreas, removendo cuidadosamente e lavagem com PBS a partir de uma garrafa de esguicho.
   8. Depois de retirar os órgãos abdominais, inspecionar os linfonodos abdominais, incluindo lombar, sacral, renal e linfonodos mesentéricos.
   9. Avaliar diafragma para a evidência de metástase.
      Nota: Ampla propagação sobre o diafragma pode fazer com que perca sua contratilidade, levando ao trabalhado ou perda da respiração.
   10. Remover diafragma e fazer duas incisões laterais na cavidade torácica, retirando a parte frontal para expor os pulmões eo coração.
   11. Remover pulmões e coração delicadamente segurando e levantando o esôfago eo corte na traquéia acima do coração. Avaliar tecidos para os nódulos. Esprema coração. A falta de consistência elástica pode indicar presente tumor.
   12. Use uma tesoura cirúrgica para cortar linearmente através do crânio. Remova cuidadosamente pequenos pedaços de crânio até ttodo ele cérebro está exposto. Olhe ao longo do cérebro para nódulos visíveis ou anomalias descolorações.

Resultados

Figura 1A mostra um esquema que define os procedimentos detalhados neste resumo protocolo. Vários fatores importantes devem ser considerados para cada etapa. Por exemplo, no Passo 1 que mostra dois métodos para a implantação de células de tumor sub-capsular para o rim. As células tumorais podem ser implantados no espaço sub-capsular com um pequeno branco-bolha confirmando a colocação localizada de células com fugas impedido por remoção cuidadosa da agulha e limpando o excesso de escape de fl...

Discussão

O objectivo deste protocolo é o de avaliar a doença metastática espontâneo clinicamente relevantes usando um modelo do rato tumor singênico para descrever técnicas de implantação / ressecção. Actualmente, a maioria dos estudos pré-clínicos de novas terapêuticas experimentais avaliando não incluir o estudo de doença metastática e apenas poucos recapitulam as fases de crescimento do tumor primário, a ressecção cirúrgica, e eventual metástase espontânea. Até o momento, modelos de ratos geneticamente ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Trypsin EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-162-35
Pocket pro pet trimmer	Braintree scientific	CLP9931B
Alcohol swab	VWR	326895
Betadine solution swab	VWR	67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"	Southpointe surgical	RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long	Kent scientific	INS15915	need two of these
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7635-01
30 G, 45 degree, RN needle	Hamilton	7803-07
Sterile cotton tipped appicator	VWR	10805-144
High temperature cautery kit	Kent scientific	INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle	Ethicon	J834
Reflex clip applier for 7 mm clips	Kent scientific	INS500343
Reflex clips, 7 mm, non-sterile	Kent scientific	INS500344
Removing forceps, 12 cm long	Kent scientific	INS500347
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorphine 0.01 mg/ml
25 G 5/8" needle	VWR	BD305122
1 ml syringe w/out needle	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G