Modelado espontánea metastásico Carcinoma de células renales (CCR metastásico) en ratones después de la nefrectomía

Resumen

Modelos de progresión de la enfermedad espontánea carcinoma metastásico de células renales (CCR) pueden ser utilizados para la evaluación de los tratamientos en un entorno clínicamente relevante. Este protocolo demuestra diferentes procedimientos para la implantación de células tumorales de riñón ortotópico, nefrectomía adecuado, y finalmente describe una guía para la necropsia de puntuación visual y bioluminiscente de carga metastásica y la localización.

Resumen

Uno de los retos clave para la mejora de las pruebas de nuevas terapias experimentales en el carcinoma de células renales (CCR) es el desarrollo de modelos que fielmente recapitula progresión de la enfermedad metastásica temprana y tardía etapa. Modelos típicos implantación del tumor utilizan la implantación del tumor primario ectópico o ortotópico, pero pocos incluyen la enfermedad metastásica espontánea sistémica que imita el entorno clínico. Este protocolo describe los pasos clave para el desarrollo de la progresión de la enfermedad RCC en escena similar a los pacientes. En primer lugar, se utiliza un ratón línea celular de tumor altamente metastásica en un modelo singénico para mostrar la implantación de células del tumor ortotópico. Los métodos incluyen la implantación superficial e interna en el espacio subcapsular con células combinadas con Matrigel para evitar fugas y la propagación temprana. Siguiente que describe los procedimientos para la escisión de portador de un tumor de riñón (nefrectomía), con cuidado de ratón pre-y post-quirúrgico crítico. Por último, se describen los pasos necesarios para controlar y evaluarmicro y macro-evolución de la enfermedad metastásica, incluyendo imágenes bioluminiscentes, así proporciona una guía visual necropsia detallada para anotar distribución de la enfermedad sistémica. El objetivo de esta descripción del protocolo es facilitar el uso generalizado de los modelos CCR metastásico clínicamente relevantes para mejorar el valor predictivo de la futura prueba terapéutica.

Introducción

La causa principal de mortalidad en pacientes con carcinoma de células renales (RCC) es la enfermedad metastásica sistémica que se produce normalmente después de la extracción quirúrgica de un tumor primario de crecimiento en el riñón. Sin embargo, muy pocos modelos tumorales preclínicos que evaluaron terapéutica experimental en ratones incluyen la enfermedad metastásica, y menos aún recapitulan fielmente las etapas clínicas de crecimiento localizado, la cirugía, y el inicio de micro-metástasis espontánea y progresión ^1-3. Esta brecha en la prueba se ha convertido cada vez más importante en la evaluación de nuevas terapias como a veces sorprendentes efectos antitumorales observados en modelos animales no siempre se tradujo en un éxito similar tratamiento de los pacientes ^4. Estas diferencias en los resultados pueden deberse a eficacias de drogas diferenciales entre modelos de tumores localizados ectópicos o ortotópico primarios y la fase tardía de la enfermedad metastásica ^5-7. En el caso de RCC, sólo unos pocos estudios han empleado establecieron unNimal protocolos que incluyen la enfermedad recurrente espontánea que imita los pacientes que típicamente han tenido riñones con tumores en su totalidad o parcialmente removidos ^2,3. Las razones de esta escasez de pruebas de modelo de ratón varían. En primer lugar, es el alto costo de los animales y la variabilidad inherente de la selección de las células tumorales y el potencial metastásico. Por ejemplo, las líneas celulares de riñón humano tienden a hacer metástasis raramente, y deben ser seleccionados a través de múltiples rondas de implantación primaria ortotópico metastásico y selección para derivar las variantes que difunden de manera consistente y forman lesiones a distancia (véase la descripción de una línea celular tal derivación humana ^8-10) . Por el contrario, las células de ratón en modelos inmunocompetentes tienden a comportarse de manera agresiva, y los números bajos de células deben ser inyectados con matrigel para reducir la diseminación sistémica inmediata ^3. En segundo lugar, las dificultades técnicas para la realización de la implantación adecuada, la resección quirúrgica (nefrectomía), y el seguimiento (y cuantificar) metastati espontáneac del crecimiento puede ser un reto y varias variables críticas que plantearse cuando se emplea esta técnica (véase la discusión para más detalles). El objetivo de este protocolo es describir los pasos esenciales (así como los peligros potenciales) de la implantación ortotópica, la resección (nefrectomía), y el seguimiento de la enfermedad CCR metastásico espontánea y ofrecer una guía para estandarizada (y más extendido) utilizar los laboratorios científicos que evalúan la eficacia de la terapéutica experimental.

Protocolo

1. Ortotópico tumor de riñón Implantación

1. Cultivo Celular
   1. Antes de la implantación ortotópica, crecer células de ratón RENCA ^LUC como una monocapa a 75% de confluencia.
   2. Después de tripsinización y resuspensión en 5% de FBS que contiene los medios de comunicación, centrifugar las células a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min, repetir 3 veces para lavar en PBS. A continuación, volver a suspender las células en medio libre de suero a una concentración de 5 x 10 ⁴ RENCA ^LUC / 5 medios libres de suero l.
      Nota: En función de la variante o línea celular utilizada, las células pueden ser resuspendidas en una proporción de matrigel y medio libre de suero 1:01 para frenar el crecimiento de células de ratón altamente agresivo y difusión después de la implantación.
2. La cirugía y la implantación de células
   Nota: Todos los estudios con animales descritos en el mismo, incluyendo el mantenimiento y la determinación de los criterios de valoración experimentales, se llevaron a cabo de acuerdo con un Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional (IACUC) protocol aprobado por el Instituto del Cáncer Roswell Park.
   1. Anestesie un ratón Balb / c usando isoflurano (2-3%). Una pizca de pie y comprobar si el reflejo de asegurar una buena anestesia. Aplique un ungüento veterinario para los ojos para evitar que se sequen. Coloque el ratón en decúbito lateral derecho y afeitar lado izquierdo entre proa y de las extremidades posteriores. Aplicar el alcohol y yodo a lo largo de área lumbar dorsal para preparar asépticamente área para la incisión.
   2. Utilice tijeras quirúrgicas para iniciar una incisión en la piel 1 cm en una dirección longitudinal entre la última costilla y la articulación de la cadera. Aflojar tejido conectivo debajo de la piel utilizando una tijera disección roma. Con unas tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de 0,5 cm en una dirección longitudinal en la pared abdominal. Utilice pinzas curvas para empujar suavemente hacia abajo alrededor de la herida abierta - esto exteriorizar el riñón y permitir la inmovilización suave de órgano antes de la inyección.
   3. Cargue la jeringa Hamilton con 5 l de la mezcla de células preparado. Para implan sub-capsularestaciones, dos métodos de implantación pueden ser empleados:
      1. Superficie: En paralelo a los riñones, la aguja de inserción longitudinalmente orientado bajo la cápsula renal (pero por encima del parénquima) con el borde biselado hacia arriba. Una vez que la aguja está en su lugar, se inyecta todas las células, hasta las formas pequeñas burbujas blancas. Quite lentamente la aguja de la cápsula y secar de inmediato sobre la inyección con un algodón con punta de aplicador estéril para absorber cualquier fuga y prevenir la difusión celular.
      2. Interna: Con borde biselado y hasta comenzando desde el lado opuesto de riñón para sitio de implantación final, insertar la aguja a través del interior de riñón hasta que la aguja es visible (pero no la punción) el espacio subcapsular. Inyectar todas las células hasta que se forme burbujas blancas y lugar de la inyección hisopo para evitar cualquier fuga.
   4. Regresar suavemente el riñón a la cavidad del cuerpo. Cierre de la pared corporal abdominal utilizando sutura absorbible 5-0 Vicryl. Una vez terminado, tire de la capa de la piel juntos y colocar 2-3 wound clips. Asegurar clips son firmes y uniformemente espaciadas para asegurar que no la exposición de la herida. Antes de la recuperación de administrar 500 l de NaCl al 0,9% y 100 l de buprenorfina (0,01 mg / ml) por vía subcutánea utilizando una aguja de 25. Monitorear rutinariamente la colocación y la estabilidad clip, y quitar después de 10 días.

2. Nefrectomía / Extirpación de Primaria

1. Siga el protocolo idéntico para anestesia ratón, inmovilización, incisión, y la exposición de los riñones, como se describe en las secciones 1.2.1 y 1.2.2 (arriba).
2. Utilice un segundo par de pinzas para aislar el riñón mediante la eliminación suavemente el tejido graso de conexión desde el extremo caudal y la glándula suprarrenal desde el extremo craneal del riñón. Mientras sujeta suavemente el riñón, el uso de sutura absorbible 5-0 Vicryl para hacer un doble nudo alrededor del uréter, la arteria renal y la vena. Poco a poco seguro y luego se corta por encima del nudo para extraer el riñón. Si cualquier señal de inmediato la pérdida de sangre, o se corre el riesgo de retención insuficientede sutura en el uréter, la arteria y la vena, a continuación, utilizar cauterizador en lugar de tijeras para cortar por encima de nudo.
3. Una vez que se elimina el riñón, revise cuidadosamente cualquier sangrado de la arteria atada y use cauterizador si es necesario. Cierre de la pared abdominal del cuerpo usando Vicryl 5-0. Tire de la capa de la piel juntos y colocar 2-3 grapas para heridas tras mismas precauciones como se describe en 1.2.4. Seguir de cerca los animales todos los días después de la cirugía para detectar signos de malestar, sangrado o movilidad reducida. Siga las directrices del centro para animales de manera segura.

3. Monitoreo metastásico Progresión y localización en el punto final

1. Cuantificación de la enfermedad metastásica: monitoreo bioluminiscente
   1. Ver metodología descrita previamente en JOVE para el seguimiento de metástasis utilizando células transfectadas con luciferasa y se cuantifica utilizando el sistema de imágenes de Xenogen IVIS ^11,12.
2. Guía visual necropsia para la evaluación comparativa de la distribución metastásicación
   1. Sacrificar animales de acuerdo a las directrices institucionales que utilizan criterios de valoración que incluyen signos de sufrimiento, dificultad para respirar, pérdida de peso, etc
      Nota: estrecha vigilancia de los animales es fundamental, ya la progresión metastásica espontáneo puede ser muy variable y rápida.
   2. Utilice tijeras quirúrgicas para iniciar una incisión por encima de la uretra, que continúa hasta la cavidad torácica a la mandíbula inferior. Con unas tijeras de extremos romos para separar la piel del músculo de la pared abdominal.
   3. Iniciar incisiones a lo largo de los brazos y las piernas. Pelar la piel de distancia. Examine de cerca la fascia de la piel y la pared abdominal de los nódulos, entonces los ganglios linfáticos superficiales: inguinal, braquial, axilar y cervical superficial.
   4. Hacer una incisión en la pared abdominal y cortar a lo largo de los lados laterales izquierdo y derecho hasta el diafragma. Con un corte horizontal quitar la parte frontal de la pared abdominal para desnudar las vísceras.
   5. Examine la apariencia tranquila de las vísceras fo gravemente tumores notables. También tenga en cuenta el contenido del estómago y los intestinos; si están vacíos, el ratón puede no haber sido capaz de comer. Si el contenido es oscuro, esto puede indicar evidencia de hemorragia gastrointestinal superior / inferior.
   6. Visualmente la puntuación de cada órgano de la presencia o ausencia de tumor, la asignación de una puntuación total de cada grupo de ratones (4 animales por grupo se utiliza como ejemplo en la Figura 1D-i).
      Notas: 1) La ampliación de los ganglios linfáticos no significa necesariamente que se trata de un crecimiento tumoral; si es muy grande, muy firme y un color blanquecino, es probable un nódulo metastásico. 2) lechosa excesivo o líquido turbio en el abdomen indica ascitis. La ascitis pueden incluir acumulaciones sólidas sobre los órganos abdominales, en particular entre los lóbulos del hígado y el estómago. 3) para los órganos como los pulmones, nódulos múltiples pueden estar presentes y contados para las comparaciones entre animales individuales (véase ^13, por ejemplo).
   7. Identificar los tumores brutos o anomalías de los órganos abdominales individuales: hígado, bazo, riñones y páncreas mediante la eliminación y el lavado con PBS cuidadosamente una botella con atomizador.
   8. Después de la eliminación de los órganos abdominales, inspeccionar los ganglios linfáticos abdominales, incluyendo la zona lumbar, sacra, renal, y ganglio linfático mesentérico.
   9. Evaluar diafragma para evidencias de diseminación metastásica.
      Nota: Amplia difusión en el diafragma puede causar que pierda su contractilidad, lo que lleva a la dificultosa o pérdida de la respiración.
   10. Retire el diafragma y hacer dos incisiones laterales en la cavidad torácica, la eliminación de la porción frontal para exponer los pulmones y el corazón.
   11. Eliminar pulmones y el corazón agarrando y levantando suavemente el esófago y el corte de la tráquea por encima del corazón. Evaluar los tejidos de nódulos. Apriete corazón. La falta de consistencia elástica puede indicar tumor presente.
   12. Utilice tijeras quirúrgicas para cortar linealmente a través del cráneo. Retire con cuidado los pequeños trozos de cráneo hasta ttodo él cerebro está expuesto. Busque en todo el cerebro en busca de nódulos visibles o anormalidades de las decoloraciones.

Resultados

Figura 1A muestra un esquema delineando los procedimientos detallados en este resumen de protocolo. Varios factores importantes deben ser considerados para cada paso. Por ejemplo, en el paso 1 se muestran dos métodos para la sub-capsular implantación de células tumorales en el riñón. Las células tumorales se pueden implantar en el espacio subcapsular con un pequeño blanco-burbuja de confirmar la colocación localizada de células con fugas impedido por la eliminación cuidadosa de la aguja y limp...

Discusión

El propósito de este protocolo es para evaluar la enfermedad metastásica espontánea clínicamente relevante utilizando un modelo de ratón del tumor singénico para describir las técnicas de implantación / resección. Actualmente, la mayoría de los estudios preclínicos evaluación de nuevas terapias experimentales no incluyen el estudio de la enfermedad metastásica y sólo unos pocos recapitular las etapas de crecimiento del tumor primario, la resección quirúrgica, y la eventual diseminación metastásica espo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Trypsin EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-162-35
Pocket pro pet trimmer	Braintree scientific	CLP9931B
Alcohol swab	VWR	326895
Betadine solution swab	VWR	67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"	Southpointe surgical	RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long	Kent scientific	INS15915	need two of these
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7635-01
30 G, 45 degree, RN needle	Hamilton	7803-07
Sterile cotton tipped appicator	VWR	10805-144
High temperature cautery kit	Kent scientific	INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle	Ethicon	J834
Reflex clip applier for 7 mm clips	Kent scientific	INS500343
Reflex clips, 7 mm, non-sterile	Kent scientific	INS500344
Removing forceps, 12 cm long	Kent scientific	INS500347
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorphine 0.01 mg/ml
25 G 5/8" needle	VWR	BD305122
1 ml syringe w/out needle	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G