Nephrectomy דוגמנות קרצינומה ספונטני גרורתי של תאי כליות (mRCC) בעכברים בעקבות

Summary

מודלים של התקדמות מחלה הספונטנית גרורתי קרצינומה של תאי כליות (RCC) יכולים לשמש להערכת טיפולים בסביבה רלוונטית מבחינה קלינית. פרוטוקול זה מדגים הליכים שונים להשתלת תאים סרטניים בכליות orthotopic, כריתת כליה תקינה, ולבסוף מתאר מדריך נתיחה לאחר מוות לניקוד חזותי וbioluminescent של נטל ולוקליזציה גרורתי.

Abstract

אחד האתגרים המרכזיים לבדיקה משופרת של תרופות ניסיוניות חדשות בקרצינומה של תאי כליות (RCC) הוא הפיתוח של מודלים שנאמנו לסכם את התקדמות מחלה גרורתית מוקדמת ושלב מאוחר. מודלים השתלת גידול אופייניים לנצל השתלת גידול ראשוני מחוץ לרחם או orthotopic, אבל כמה כוללים מחלה גרורתית ספונטנית מערכתית המחקה את הסביבה הקלינית. פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים לפתח את התקדמות מחלה בשלבי RCC דומה לחולים. ראשית, הוא משתמש בשורת תאים גרורתי מאוד בעכבר גידול במודל syngeneic להראות השתלת תאים סרטניים orthotopic. שיטות כוללות השתלה שטחית ופנימית לתוך החלל תת קופסית עם תאים בשילוב עם matrigel כדי למנוע דליפה והתפשטות מוקדמת. הבא זה מתאר את ההליכים לכריתה של גידול נושאות כליה (כריתת כליה), בזהירות עכבר ומראש לאחר ניתוח קריטי. לבסוף, הוא מתאר את הצעדים הדרושים כדי לפקח ולהעריךמיקרו ומקרו גרורתי התקדמות מחלה, כולל ההדמיה bioluminescent כמו גם מספק מדריך נתיחה לאחר מוות חזותי מפורט להבקיע הפצת מחלה מערכתית. המטרה של תיאור פרוטוקול זה היא להקל על השימוש הנרחב של מודלים RCC גרורתי רלוונטיים מבחינה קלינית כדי לשפר את ערך החיזוי של בדיקות טיפוליות עתידיות.

Introduction

הגורם העיקרי לתמותה בחולים עם קרצינומה של תאי כליות (RCC) הוא מחלה גרורתית מערכתית שמתרחשת בדרך כלל בעקבות ניתוח להסרת גידול ראשוני גדל בכליות. עם זאת, מעט מאוד מודלים גידול פרה הערכת תרופות ניסיוניות בעכברים כוללים מחלה גרורתית, ועוד פחות מזה בנאמנות לשחזר את השלבים הקליניים של גידול מקומי, ניתוח, וייזום מיקרו גרורתי ספונטני והתקדמות ^1-3. פער בבדיקה זו הפך להיות חשוב יותר ויותר בהערכה של טיפולים חדשים כמו שלפעמים השפעות אנטי סרטניים מרשימות לראות במודלים של בעלי חיים לא תמיד מתורגמות לטיפול מוצלח באופן דומה של חולים ^4. הבדלים כאלה בתוצאות עשויים לנבוע מefficacies תרופת ההפרש בין דגמים המקומיים מחוץ לרחם או orthotopic גידול ראשוניים ומחלה גרורתית בשלב מאוחר ^5-7. במקרה של RCC, רק מחקרים מעטים הועסקו הוקםפרוטוקולי nimal הכוללים הישנות מחלה ספונטנית שמחק חולים שבדרך כלל יש לו כליות נושאות גידולים באופן מלא או באופן חלקי הוסרו ^2,3. הסיבות למחסור זה בבדיקות במודל עכבר להשתנות. ראשית, יש את העלות של בעלי החיים הגבוהה וההשתנות הגלומה בבחירת תאי גידול ואת הפוטנציאל גרורתי. לדוגמא, שורות תאי כליה אנושיות נוטות לשלוח גרורות לעתים נדירות, ויש לבחור על סיבובים רבים של השתלה ראשונית orthotopic ובחירה גרורתי להפיק גרסאות שאופן עקבי להפיץ ויוצרים נגעים רחוקים (ראו תיאור של גזירת שורת תאים אנושית כגון ^8-10) . לעומת זאת, תאי עכבר במודלים של מערכת חיסון נוטים להתנהג בצורה אגרסיבית, ומספרי תא נמוכים חייבים להיות מוזרקים עם matrigel להפחית התפשטות מערכתית מיידית ^3. שנית, metastati ספונטני קשיים טכניים בביצוע השתלה נכונה, כריתה כירורגית (כריתת כליה), ומעקב (וכימות)צמיחת ג יכולה להיות מאתגרת ומספר משתנים קריטיים צריכים חשבון בעת ​​העסקת טכניקה זו (ראה דיון לפרטים נוספים). מטרתו של פרוטוקול זה היא לתאר את הצעדים החיוניים (כמו גם בעיות פוטנציאליות) של השתלת orthotopic, כריתה (כריתת כליה), וניטור של מחלת RCC גרורתי ספונטנית ולהציע קו מנחה לסטנדרטי (ונפוץ יותר) להשתמש בין מעבדות מדעיות כי להעריך את היעילות של תרופות ניסיוניות.

Protocol

1. השתלת גידול בכליות Orthotopic

1. תרבית תאים
   1. לפני השתלת orthotopic, לגדל תאי עכבר RENCA ^לוק כmonolayer לconfluency 75%.
   2. בעקבות trypsinization וresuspension בתקשורת 5% FBS המכיל, תאי צנטריפוגות ב 1,000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, חוזרים 3 פעמים כדי לשטוף ב-PBS. אז resuspend התאים בסרום ללא מדיה לריכוז של 5 x 10 ^{4 לוק} / 5 סרום ללא מדיה μl RENCA.
      הערה: בהתאם לגרסה או הקו סלולרי בשימוש, ניתן resuspended תאי ביחס של 1:1 מmatrigel ותקשורת חופשית בסרום כדי להאט צמיחה אגרסיבית מאוד עכבר תא והפצה לאחר השתלה.
2. השתלת ניתוח ותא
   הערה: כל המחקרים בבעלי החיים שמתוארים בו, כוללים תחזוקה ונחישות של נקודות קצה ניסיוניות, בוצעו על פי עמ 'ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש מוסדית (IACUC)rotocol אושר על ידי Roswell Park Cancer Institute.
   1. הרדימי אחד עכבר BALB / C באמצעות Isoflurane (2-3%). צבוט את הרגל ולבדוק לרפלקס כדי להבטיח הרדמה מספיק. החל משחה וטרינר לעיניים כדי למנוע התייבשות. העבר את העכבר שכיבה לרוחב נכון ולגלח את צד שמאל בין קדמי ואחורי גפה. החל אלכוהול ויוד לאורך אזור המותני הגבי להכין סביבה נקיה מחיידקים באזור לחתך.
   2. השתמש במספריים כירורגית ליזום חתך בעור 1 סנטימטר בכיוון אורך בין הצלע האחרונה ומפרק הירך. שחרר רקמת חיבור מתחת לעור באמצעות מספריים לנתיחה בוטים. השתמש במספריים כירורגית כדי לעשות חתך 0.5 סנטימטר בכיוון אורך בדופן הבטן. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לדחוף למטה בעדינות סביב פצע פתוח - זה יהיה exteriorize הכליות ולאפשר לקיבוע עדין של איבר לפני הזריקה.
   3. טען את מזרק המילטון עם 5 μl תערובת התא מוכנה. לimplan תת קופסיתtations, יכולה להיות מועסקות בשתי שיטות השתלה:
      1. שטחי: ריצה במקביל לכליות, מחט להכניס חוקיים אורכים תחת הקפסולה הכליות (אבל מעל parenchyma) עם הקצה המשופע מעלה. ברגע שהמחט נמצאת במקומו, מזריק את כל התאים עד צורות בועה הלבנות קטנות. לאט לאט להסיר את המחט מכמוסה ומייד למחוק מעל הזרקה עם המוליך כותנה שקצהו סטרילי כדי לספוג כל דליפה ולמנוע הפצת תא.
      2. פנימי: עם קצה למעלה ומתחילים מהצד של ההפך כליה לאתר השתלה סופי משופעים, להכניס מחט דרך הפנים של כליות עד המחט גלויה (אך לא ניקוב) החלל תת קופסית. הזרק את כל התאים עד צורות בועה לבנה ואתר הזרקת ספוגית כדי למנוע כל דליפה.
   4. בעדינות להחזיר את הכליות לחלל הגוף. סגור את קיר גוף הבטן באמצעות תפר 5-0 Vicryl נספג. לאחר ההשלמה, למשוך את שכבת העור יחד ומניח 2-3 wound קליפים. קליפים להבטיח איתנים ומחולק באופן שווה כדי להבטיח שאין חשיפת פצע. לפני ההתאוששות לנהל 500 μl של .0.9% NaCl ושל עצירות (0.01 מ"ג / מיליליטר) 100 μl מתחת לעור באמצעות מחט 25 G. באופן שיגרתי לפקח מיקום סרטון ויציבות, ולהסיר אחרי 10 ימים.

2. Nephrectomy / הסרת גידול ראשונית

1. עקוב פרוטוקול זהה להרדמת עכבר, חוסר תנועה, חתך, וחשיפה של כליות כמתואר בסעיפי 1.2.1 ו 1.2.2 (לעיל).
2. השתמש זוג שני של מלקחיים על מנת לבודד את הכליות בעדינות על ידי הסרת רקמת חיבור שומן מקצה הזנב ואת בלוטת יותרת הכליה מקצה הגולגולת של הכליה. בעוד לתפוס את הכליות בעדינות, להשתמש תפר נספג 5-0 Vicryl לעשות קשר כפול סביב השופכן, עורק כליה, ווריד. לאט מאובטח ולאחר מכן לחתוך מעל הקשר כדי להסיר את הכליה. אם כל סימן של איבוד דם באופן מיידי, או שיש סיכון לאחיזה מספיקהתפר בשופכן, עורק, וריד, ואז להשתמש cauterizer במקום מספריים לחתוך מעל קשר.
3. ברגע שהכליות מוסרות, לבדוק היטב עבור כל דימום מהעורק קשור ולהשתמש cauterizer במידת צורך. סגור את קיר גוף הבטן באמצעות 5-0 Vicryl. משוך את שכבת העור יחד ומניח 2-3 קליפים פצע הבא באותו אמצעי זהירות כפי שתואר ב1.2.4. לעקוב מקרוב אחר בעלי חיים יומיים לאחר ניתוח לסימני מצוקה, דימום, או ניידות מוגבלת. פעל לפי הנחיות מוסדיות לבעלי חיים בבטחה.

3. ניטור גרורתי התקדמות ולוקליזציה בנקודתי קצה

1. כימות מחלה גרורתית: ניטור Bioluminescent
   1. ראה המתודולוגיה שתוארה קודם לכן ביופיטר לניטור גרורות באמצעות תאי transfected עם לוציפראז ולכמת באמצעות ^11,12 מערכת ההדמיה Xenogen IVIS.
2. מדריך לנתיחה לאחר מוות ויזואלי להערכה השוואתית של חלוקה גרורתיtion
   1. להקריב את החיות על פי הנחיות מוסדיות באמצעות נקודות קצה, כולל סימני מצוקה, נשימה מאומצת, ירידה במשקל, וכו '
      הערה: ניטור מדוקדק של בעלי חיים הוא קריטי כמו התקדמות גרורתית ספונטנית יכולה להיות משתנה ומהירה מאוד.
   2. השתמש במספריים כירורגית ליזום חתך מעל השופכה שממשיכה את חלל בית החזה ללסת תחתונה נמוכה יותר. השתמש במספריים הסתיימו בוטים להפריד את העור מהשרירים של דופן הבטן.
   3. ליזום חתכים לאורך זרועות ורגליים. עור פיל משם. מקרוב לבחון את fascia העור וקיר בטן לגושים, ואז בלוטות הלימפה השטחיות: מפשעתי, זרוע, בית השחי וצוואר הרחם שטחי.
   4. עושה חתך בדופן הבטן ולחתוך לאורך הצדדים לרוחב שמאלה וימינה עד לסרעפת. עם חתך אחד אופקי להסיר את החלק הקדמי של דופן הבטן חשופה הקרביים.
   5. לבחון את המראה בלתי מופרע של f הקרבייםאו גס גידולים ראויים לציון. כמו כן שים לב את התוכן של הקיבה ומעיים; אם הם ריקים, העכבר אולי לא היה מסוגל לאכול. אם התוכן הוא כהים, זה עשוי להצביע על ראיות של דימום עליון / תחתון של קיבה ומעיים.
   6. מבחינה ויזואלית להבקיע כל איבר לנוכחות גידול או היעדרות, הקצאת ציון הכולל לכל קבוצה בעכבר (4 חיות לכל קבוצה משמשת כדוגמא באיור 1D-i).
      הערות: 1) הגדלה של בלוטות הלימפה לא בהכרח אומרת שזה גידול הסרטני; אם כן, הוא במידה רבה בגודל, תקיף מאוד, וצבע לבנבן, סביר להניח גולה גרורתי. 2) חלבי מוגזם או נוזל עכור בבטן מצביע על מיימת. מיימת עשויה לכלול הצטברויות מוצקות על אברי הבטן, במיוחד בין האונות של הכבד והקיבה. 3) לאיברים כגון ריאות, גושים מרובים יכולים להיות נוכחים ונספר להשוואות בין בעלי חיים הבודדים (ראה ¹³ לדוגמא).
   7. לזהות גידולי ברוטו או מומים של אברי בטן הבודדים: כבד, טחול, כליות ולבלב על ידי הסרת בזהירות ושטיפה עם PBS מבקבוק להשפריץ.
   8. לאחר הסרת אברי הבטן, לבדוק את בלוטות הלימפה בבטן, כוללים המותני, עצם העצה, כליות, ובלוטות לימפה mesenteric.
   9. להעריך סרעפת עדויות להתפשטות גרורה.
      הערה: התפשטות נרחבת על הסרעפת יכולה לגרום לו לאבד את התכווצותו, מה שמוביל לעמל או אובדן הנשימה.
   10. הסר את הסרעפת ולעשות שני חתכים רוחב בחלל בית החזה, הסרת החלק הקדמי על מנת לחשוף את הריאות ולב.
   11. הסר את ריאות ולב בעדינות על ידי אחיזה ומרים את הוושט וחיתוך קנה הנשימה מעל הלב. להעריך רקמות לגושים. סוחטים את לב. חוסר העקביות קפיצית עשוי להצביע על הווה גידול.
   12. השתמש במספריים כירורגית לחתוך באופן ליניארי דרך גולגולת. להסיר בעדינות חתיכות קטנות של גולגולת עד שלאהמוח כולו הוא נחשף. חפש בכל רחבי מוח לגושים גלויים או כתמי מומים.

תוצאות

איור 1 א מציג סכמטי המתווה את הנהלים המפורטים בסיכום פרוטוקול זה. מספר גורמים חשובים יש לקחת בחשבון לכל צעד. לדוגמא, בשלב 1 זה מראה שתי שיטות להשתלת תאים סרטניים תת קופסית לתוך הכליה. יכולים להיות מושתלים תאים סרטניים לתוך החלל תת קופסית עם לבן בועה קטנה המאשר?...

Discussion

מטרתו של פרוטוקול זה היא להעריך מחלה גרורתית ספונטנית רלוונטית קליני תוך שימוש במודל עכבר גידול syngeneic לתאר טכניקות השתלה / כריתה. כיום, הרוב המכריע של מחקרים פרה הערכת תרופות ניסיוניות רומן אינו כולל מחקר של מחלה גרורתית ורק מעטים לשחזר את השלבים של צמיחת גידול ראשונ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Trypsin EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-162-35
Pocket pro pet trimmer	Braintree scientific	CLP9931B
Alcohol swab	VWR	326895
Betadine solution swab	VWR	67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"	Southpointe surgical	RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long	Kent scientific	INS15915	need two of these
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7635-01
30 G, 45 degree, RN needle	Hamilton	7803-07
Sterile cotton tipped appicator	VWR	10805-144
High temperature cautery kit	Kent scientific	INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle	Ethicon	J834
Reflex clip applier for 7 mm clips	Kent scientific	INS500343
Reflex clips, 7 mm, non-sterile	Kent scientific	INS500344
Removing forceps, 12 cm long	Kent scientific	INS500347
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorphine 0.01 mg/ml
25 G 5/8" needle	VWR	BD305122
1 ml syringe w/out needle	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G