Modellierung Spontane metastasiertem Nierenzellkarzinom (mRCC) in Mäusen nach Nephrektomie

Zusammenfassung

Modelle der spontanen metastasiertem Nierenzellkarzinom (RCC) den Krankheitsverlauf kann für die Bewertung Behandlungen in einer klinisch relevanten Einstellung verwendet werden. Dieses Protokoll zeigt verschiedene Verfahren für orthotope Nierentumorzellimplantation, richtige Nephrektomie und schließlich skizziert eine Obduktion Führer für visuelle und Biolumineszenz-Scoring von metastasierendem Belastung und Lokalisierung.

Zusammenfassung

Eine der wichtigsten Herausforderungen für die verbesserte Prüfung von neuen experimentellen Therapie beim Nierenzellkarzinom (RCC) ist die Entwicklung von Modellen, die treu zu rekapitulieren Früh-und Spätstadium metastasierendem Krankheitsprogression. Typische Tumorimplantation Modelle verwenden oder Eileiter orthotopen Primärtumorimplantation, aber nur wenige sind spontane systemische Metastasen, die den klinischen Umgebung nachahmt. Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Entwicklung RCC Fortschreiten der Krankheit ähnlich inszeniert für die Patienten. Zuerst, verwendet es eine stark metastasierenden Maus-Tumor-Zelllinie in einem syngenen Modell orthotope Tumorzellimplantation zu zeigen. Zu den Methoden gehören oberflächlich und interne Implantation in den Kapselunter Raum mit Zellen kombiniert mit Matrigel, um ein Auslaufen und frühen Ausbreitung zu verhindern. Weiter ist das Verfahren zur Entfernung der tumortragenden Niere (Nephrektomie) beschreibt, mit kritischen prä-und postoperative Versorgung der Maus. Schließlich beschreibt die notwendigen Schritte, um sie zu überwachen und zu bewertenMikro-und Makro-metastatischen Progression der Erkrankung, einschließlich Biolumineszenz-Bildgebung sowie eine detaillierte visuelle Obduktion Leitfaden für systemische Erkrankung Verteilung punkten. Das Ziel dieser Protokollbeschreibung ist es, die weit verbreitete Verwendung von klinisch relevanten metastasierendem RCC Modelle, um die Vorhersagewert von Tests zukünftige therapeutische Verbesserung zu erleichtern.

Einleitung

Die Hauptursache der Sterblichkeit bei Patienten mit Nierenzellkarzinom (RCC) ist eine systemische Metastasen, die typischerweise auftritt, nach chirurgischer Entfernung eines Primärtumors wächst in der Niere. Sehr wenige präklinischen Tumormodellen Auswertung experimenteller Therapeutik in Mäusen sind jedoch Metastasen, und noch weniger treu die klinischen Phasen der lokalisierten Wachstum, Chirurgie und spontane Mikro-Metastasen Initiierung und Progression ^1-3 rekapitulieren. Diese Lücke im Test hat sich bei der Bewertung neuer Therapien wie manchmal auffällig Anti-Tumor-Wirkung in Tiermodellen gesehen, nicht immer in ähnlich erfolgreiche Behandlung von Patienten ⁴ setzten immer wichtiger. Solche Unterschiede in den Ergebnisse können von Differentialdrogenwirkungsgrade zwischen lokalisierten oder Eileiter orthotopen Primärtumormodellen und späten Stadium Metastasen ^5-7 einzudämmen. Im Fall des RCC, haben nur wenige Studien beschäftigt etabliert einenimal-Protokolle, die spontan wiederkehrende Krankheit, die Patienten, die imitiert haben typischerweise tumortragenden Nieren hatte ganz oder teilweise entfernt, ^2,3 enthalten. Die Gründe für diesen Mangel in Maus-Modelltests variieren. Erstens gibt es die hohe Tier Kosten und der inhärenten Variabilität der Tumorzellenauswahl und metastatischen Potential. Zum Beispiel, menschliche Nierenzelllinien sind in der Regel selten metastasieren und müssen über mehrere Runden orthotopen primären und metastatischen Implantation Auswahl an Varianten, die konsequent zu verbreiten und bilden entfernten Läsionen ableiten gewählt werden (siehe Beschreibung eines solchen menschlichen Zelllinie Ableitung ^8-10) . Umgekehrt, bei immunkompetenten Zellen der Maus Modelle neigen dazu, aggressiv zu verhalten und geringe Zellzahlen müssen mit Matrigel sofortige systemische Ausbreitung ³ reduzieren injiziert werden. Zweitens, technische Schwierigkeiten bei der Durchführung richtige Implantation, chirurgische Resektion (Nephrektomie) und Tracking (und Quantifizierung) spontane metastatic Wachstum kann eine Herausforderung sein und mehrere kritische Variablen müssen berücksichtigen, wenn diese Technik verwenden (siehe Diskussion für Details). Der Zweck dieses Protokolls ist es, die wesentlichen Schritte (wie auch mögliche Fallstricke) des orthotopen Implantation Resektion (Nephrektomie) und die Überwachung der spontanen metastasierendem RCC Krankheit zu beschreiben und eine Leitlinie für standardisierte (und verbreitet) bieten unter den wissenschaftlichen Labors nutzen beurteilen, dass die Wirksamkeit der experimentellen Therapeutika.

Protokoll

1. Orthotopische Nierentumorimplantation

1. Zellkultur
   1. Vor orthotopen Implantation wachsen Maus RENCA ^LUC-Zellen als Monolayer bis 75% Konfluenz.
   2. Nach Trypsinierung und Resuspension in 5% FBS enthaltendem Medium, Zellen Zentrifuge bei 1000 Upm, 4 ° C für 5 min, wiederholen 3 mal in PBS waschen. Anschließend hat ein Resuspendieren der Zellen in serumfreiem Medium auf eine Konzentration von 5 x 10 ⁴ RENCA ^LUC / 5 &mgr; l Serum-freien Medien.
      Hinweis: Je nach Variante oder Zelllinie verwendet wird, können Zellen in einem 1:1-Verhältnis von Matrigel und Serum-freie Medien zu hoch aggressive Maus Zellwachstum und die Verbreitung nach der Implantation langsam resuspendiert werden.
2. Chirurgie und Zellimplantation
   Hinweis: Alle darin beschriebenen Tierstudien, einschließlich Wartung und experimentelle Bestimmung der Endpunkte wurden nach einem Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) p durchgeführtrotocol von Roswell Park Cancer Institute genehmigt.
   1. Anesthetize ein Balb / C-Maus mit Isofluran (2-3%). Pinch Fuß und überprüfen Reflex, um eine ausreichende Betäubung gewährleisten. Bewerben Tierarzt Salbe für die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Zeigen Maus in der rechten Seitenlage und rasieren linken Seite zwischen Vorder-und Hintergliedmassen. Bewerben Alkohol und Jod zusammen dorsalen lumbalen Bereich zu Bereich für Schnitt aseptisch vorbereiten.
   2. Verwenden chirurgische Schere, eine 1 cm Hautschnitt in Längsrichtung zwischen der letzten Rippe und dem Hüftgelenk zu initiieren. Lösen Bindegewebe unter der Haut mit einem stumpfen Dissektion Schere. Verwenden chirurgische Schere, um eine 0,5 cm lange Inzision in Längsrichtung in der Bauchdecke zu machen. Verwenden gebogenen Pinzette vorsichtig nach unten drücken, um offene Wunde - das wird die Niere exteriorisieren und vor der Injektion zu ermöglichen für die schonende Immobilisierung der Orgel.
   3. Laden Sie die Hamilton-Spritze mit 5 ul der vorbereiteten Zellgemisch. Für Unterkapsel Implantologietungen können zwei Implantationsverfahren eingesetzt werden:
      1. Oberflächliche: parallele Laufen zum längsorientierte Niere, Einsatz Nadel unter die Nierenkapsel (aber über dem Parenchym) mit der abgeschrägten Kante nach oben. Sobald Nadel ist vorhanden, spritzen alle Zellen bis kleine weiße Blase bildet. Entfernen Sie langsam Nadel aus Kapsel und sofort über Injektion tupfen mit einem sterilen Wattestäbchen, um ein Auslaufen zu absorbieren und verhindern Zell Verbreitung.
      2. Intern: Mit abgeschrägten Kanten und ausgehend von der Seite der Niere gegenüber endgültige Implantationsstelle, legen Nadel durch Innere der Niere, bis die Nadel sichtbar (aber nicht Punktion) ist die Sub-Kapselraum. Spritzen Sie alle Zellen, bis weiße Blase bildet und Tupfer Injektionsstelle, um ein Auslaufen zu verhindern.
   4. Sie vorsichtig die Niere in die Körperhöhle zurück. Schließen Sie die Bauchkörperwand mit 5-0 resorbierbaren Vicryl Naht. Wenn Sie fertig sind, ziehen Sie den Hautschicht zusammen und legen Sie 2-3 wound Clips. Stellen Sie sicher, Clips sind fest und gleichmäßig verteilt, keine Wunde Belichtung ein. Vor der Verwertung verabreichen 500 &mgr; l 0,9% NaCl und 100 ul Buprenorphin (0,01 mg / ml) subkutan unter Verwendung einer 25 G-Nadel. Clip Platzierung und Stabilität routinemäßig zu überwachen, und nach 10 Tagen zu entfernen.

2. Nephrektomie / Primärtumorentfernung

1. Folgen identisches Protokoll für Maus Betäubung, Ruhigstellung, Schnitt und Belichtung von Nieren wie in den Abschnitten 1.2.1 und 1.2.2 (oben) beschrieben.
2. Verwenden eines zweiten Paars von Zangen, um die Niere durch vorsichtiges Entfernen des Verbindungs ​​Fettgewebe vom kaudalen Ende und die Nebenniere von kranialen Ende der Niere isolieren. Während sanft Greifen der Niere, verwenden resorbierbaren 5-0 Vicrylnaht einen Doppelknoten um den Harnleiter, Nierenarterie und Vene zu machen. Langsam sichere und dann über den Knoten zu zerschlagen, um die Niere zu entfernen. Bei Anzeichen von Blutverlust sofort, oder es besteht die Gefahr der unzureichenden HaltNaht auf Harnleiter, Arterie und Vene, dann verwenden cauterizer statt Schere, über Knoten zu zerschlagen.
3. Sobald Niere entfernt wird, sorgfältig zu prüfen, für jede Blutung aus der Arterie und gebunden cauterizer verwenden, wenn nötig. Schließen Sie die Bauchkörperwand mit 5-0 Vicryl. Ziehen Sie die Hautschicht zusammen und legen Sie 2-3 Wundklammern folgenden gleichen Vorsichtsmaßnahmen wie in 1.2.4 beschrieben. Tier täglich genau beobachten, nach der Operation für Anzeichen von Leiden, Blutungen oder eingeschränkter Mobilität. Folgen Sie den Richtlinien des Instituts für Tier sicher.

3. Überwachung Metastatische Progression und Lokalisierung bei Endpoint

1. Quantifizierung Metastasen: Biolumineszenz-Überwachung
   1. Siehe zuvor in JOVE für die Überwachung von Metastasen unter Verwendung von Zellen mit Luciferase transfiziert und quantifiziert mit der Xenogen IVIS Imaging-System ^11,12 beschriebenen Methodik.
2. Visuelle Obduktion Führung für die vergleichende Bewertung von metastasierendem Verteilungtion
   1. Sacrifice Tiere nach den Richtlinien des Instituts mit Endpunkten einschließlich Anzeichen von Leiden, Atemnot, Gewichtsverlust, usw.
      Hinweis: Eine genaue Überwachung der Tiere ist kritisch, da spontane metastatischen Progression kann sehr variabel und schnell.
   2. Verwenden chirurgische Schere, um einen Schnitt über der Harnröhre, die weiterhin die Brusthöhle zu Unterkiefer zu initiieren. Verwenden stumpfendig Schere, um die Haut von der Muskulatur der Bauchwand zu trennen.
   3. Initiieren Einschnitte entlang Arme und Beine. Haut entfernt. Untersuchen Sie die Haut Faszie und Bauchwand für Knoten, dann die oberflächlichen Lymphknoten: Leisten-, Arm-, Achsel-und oberflächliche Gebärmutterhalskrebs.
   4. Einen Einschnitt in der Bauchwand und entlang der linken und rechten Seitenflächen bis zu der Membran geschnitten. Mit einem horizontalen Schnitt entfernen Sie den vorderen Teil der Bauchwand, um die Eingeweide entblössen.
   5. Untersuchen Sie den ungestörten Auftritt der Eingeweide foder grob bemerkenswerte Tumoren. Beachten Sie auch den Inhalt von Magen und Darm; wenn sie leer sind, kann die Maus nicht in der Lage zu essen haben. Wenn die Inhalte sind dunkel, kann dieser Nachweis der oberen / unteren Magen-Darm-Blutung hinweisen.
   6. Visuell gäste jedes Organ für die Tumor-oder Abwesenheit, die Zuweisung einer Gesamtpunktzahl für jede Maus Gruppe (4 Tiere pro Gruppe ist als beispielsweise in 1D-i verwendet wird).
      Anmerkungen: 1) Die Erweiterung der Lymphknoten bedeutet nicht unbedingt, dass es ein Tumorwachstum; wenn es sehr große, sehr fest, und eine weißliche Farbe ist, ist es wahrscheinlich eine metastatische Knötchen. 2) Übermäßiger oder milchig trübe Flüssigkeit in der Bauchhöhle zeigt Aszites. Aszites kann fest Ansammlungen auf der Bauchorgane, insbesondere zwischen den Lappen der Leber und des Magens sind. 3) für Organe wie die Lunge, können mehrere Knoten vorhanden ist und für Vergleiche zwischen einzelnen Tieren gezählt werden (siehe zum Beispiel ^13).
   7. Identifizieren Brutto Tumoren oder Fehlbildungen der einzelnen Bauchorgane: Leber, Milz, Nieren und Bauchspeicheldrüse durch vorsichtiges Entfernen und Waschen mit PBS aus einer Spritzflasche.
   8. Nach dem Entfernen der Bauchorgane, untersuchen die Bauch Lymphknoten, einschließlich der Lenden-, Kreuzbein-, Nieren-und mesenterialen Lymphknoten.
   9. Bewerten Membran zum Nachweis von Metastasierung.
      Hinweis: Umfangreiche Verbreitung auf der Membran, kann sie seine Kontraktilität verlieren, was zu schwer oder Verlust der Atmung.
   10. Entfernen Membran und machen zwei seitliche Schnitte in die Brusthöhle, das Entfernen der Frontbereich, um die Lungen und das Herz freizulegen.
   11. Lunge und Herz entfernen, indem Sie vorsichtig Greifen und Anheben der Speiseröhre und Schneiden der Luftröhre über dem Herzen. Bewerten Gewebe für Knötchen. Squeeze Herzen. Mangel an Konsistenz kann darauf hindeuten, feder vorliegenden Tumor.
   12. Verwenden chirurgische Schere, um linear durch Schädel geschnitten. Entfernen Sie vorsichtig kleine Stücke des Schädels bis ter ganze Gehirn ausgesetzt ist. Schauen gesamten Gehirn für Knötchen oder sichtbaren Anomalien Verfärbungen.

Ergebnisse

1A zeigt eine schematische umreißt die Verfahren in diesem Protokoll Zusammenfassung aufgeführt. Mehrere wichtige Faktoren muss für jede Stufe. Zum Beispiel in Schritt 1 zeigt zwei Verfahren zur Unterkapsel Implantation der Tumorzellen in der Niere. Tumorzellen können in den Sub-Kapsel-Raum mit einem kleinen weißen Blase Bestätigung der lokalisierten Platzierung der Zellen mit Leckage durch sorgfältige Entfernung der Nadel und Abtupfen überschüssigen austretende Flüssigkeit (Abbildung ...

Diskussion

Der Zweck dieses Protokolls ist es, klinisch relevante spontane Metastasen beurteilen mit einem syngenen Tumor-Mausmodell der Implantation / Resektion Techniken zu beschreiben. Derzeit ist die Mehrheit der präklinischen Studien, die neue experimentelle Therapien nicht enthalten Studie von Metastasen und nur wenige rekapitulieren die Phasen der Primärtumorwachstum, chirurgische Resektion, und eventuelle spontane Metastasierung. Bis heute gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMS) erzeugt werden, um spontane Nierenzel...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Trypsin EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-162-35
Pocket pro pet trimmer	Braintree scientific	CLP9931B
Alcohol swab	VWR	326895
Betadine solution swab	VWR	67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"	Southpointe surgical	RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long	Kent scientific	INS15915	need two of these
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7635-01
30 G, 45 degree, RN needle	Hamilton	7803-07
Sterile cotton tipped appicator	VWR	10805-144
High temperature cautery kit	Kent scientific	INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle	Ethicon	J834
Reflex clip applier for 7 mm clips	Kent scientific	INS500343
Reflex clips, 7 mm, non-sterile	Kent scientific	INS500344
Removing forceps, 12 cm long	Kent scientific	INS500347
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorphine 0.01 mg/ml
25 G 5/8" needle	VWR	BD305122
1 ml syringe w/out needle	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G