التركيز تشكيل: A الفحص القائم على خلية لتحديد إمكانية أنكجنيك لجين

Summary

توفر الفحص التركيز تشكيل طريقة واضحة لتقييم إمكانات تحويل من الجين الورمي مرشح.

Abstract

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals¹. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)². When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci¹ that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

Introduction

الخلايا السرطانية يمكن تمييزها عن نظيراتها العادية من قبل مجموعة واسعة من التعديلات، من أنماط التعبير الجيني لepigenomics إلى تغيرات شكلية والتكاثري. ومن بين هذه الأخيرة، وخفض الاعتماد على المصل، وفقدان الاتصال (الكثافة) تثبيط، واقتناء الانتشار مرسى مستقل، وفي نهاية المطاف، القدرة على تكوين الأورام عند حقنه في الحيوانات، مؤشرات قابلة للقياس مفيدة التحول الخبيث ^3. عدة في المختبر والمقايسات فيفو تم وضعها من أجل التحول الخلوي. في المختبر فحوصات تهدف إلى تحديد وقياس التغيرات في التشكل الثقافة (التركيز تشكيل فحص)، وديناميات الثقافة (معدل النمو والكثافة التشبع)، وعامل النمو (النمو في انخفاض المصل) أو مرسى (النمو في أجار لينة) المتطلبات. لا يزال المعيار الذهبي لتحديد طبيعة الخبيثة من نوع الخلية تشكيل الورم (xenografts) في حيوانات التجارب. ومع ذلك، رانه يكلف وطول من الدراسات في الجسم الحي لا تجعل لهم دائما مبررا كخطوة أولى التحقق من صحة أو فحص الجينات المسرطنة مرشح. على الرغم من عدم الفحص في المختبر يوفر تقييم واضح للإمكانات أنكجنيك من الجين، فإنها توفر نظرة ثاقبة إمكانات أنكجنيك التي قد تضييق المستقبل في الدراسات المجراة. واحد من أكثر الأنظمة المستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانات أنكجنيك في المختبر هو التركيز تشكيل الفحص ^2. ويعتمد هذا الأسلوب على استخدام NIH 3T3 الخلايا الليفية الماوس، خط خلية غير حولت الذي يظهر تثبيط اتصال قوية. overexpression من على النتائج الجين الورمي في فقدان النمو التي تعتمد على كثافة. الخلايا تحولت يمكن بعد ذلك تنمو في طبقات متعددة، وتشكيل "بؤر"، تصور بسهولة ضد أحادي الطبقة الخلفية للخلايا غير متحول. تشكيل التركيز الفحص، ثم، يقيس قدرة الجين الورمي مرشح للحث على التحول الخبيث، كما يتضح من فقدان الاتصال inhibition باعتباره النمط الظاهري للقياس. وقد استخدم FFA لتقييم التحول من overexpression من تحركات البروتينات (على سبيل المثال، SRC ^4، BRAF ^5)، عوامل النسخ (على سبيل المثال، N-MYC ⁶⁾ مستقبلات، إلى جانب G-البروتين (على سبيل المثال، P2RY8 ⁷⁾ وGTPases (على سبيل المثال ورأس ^1)، وغيرها. السهولة النسبية لهذا الاختبار يجعلها خيارا جيدا من شأنها أن توفر إجابة واضحة وسريعة بصريا ما إذا كان overexpression من الجينات يكفي لتحويل NIH 3T3 خلايا فأر الليفية في المختبر.

وFFA الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم بلات-E خط الخلية التعبئة والتغليف ^8، والذي يوفر البروتينات الفيروسية التعبئة والتغليف، وفيروسات ناقلات pBABEpuro ⁹ (Addgene بلازميد 1764) لإنتاج الفيروس الارتجاعي. بعد ترنسفكأيشن مع بناء pBABEpuro التي تحتوي على الجينات في المصالح، فإن خط الخلية بلات-E تنتج الارتجاعي ecotropic التي يمكن استخدامها لتصيب خلايا NIH 3T3. تيطريقة الفيروسي له من توصيل الجينات هو أكثر فعالية من الأساليب ترنسفكأيشن الكيميائية التقليدية، وأنه يوفر وسيلة للتعبير عن هذا الجين على نحو مستدام ^10. مرة واحدة دمجها في جينوم الخلايا NIH 3T3، والدافع overexpression من هذا الجين من الفائدة من جانب يكرر محطة الطويلة الفيروسية (LTR) المروج ^11. ويمكن استخدام هذا التعبير المستمر لتحديد ما إذا كانت الجينات في المصالح والنشاط أنكجنيك، مقاسا تشكيل بؤر، على خلايا NIH 3T3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. جعل النواقل الفيروسية

تسلسل الترميز لهذا الجين من الفائدة، فضلا عن الضوابط الإيجابية والسلبية، تندس في pBABEpuro بالطرق التقليدية الاستنساخ (PCR التضخيم، والهضم تقييد وربط). هناك أربعة مواقع قيود على ناقلات حيث يمكن إدخال DNA: إنزيم BamHI، SnaBI، EcoRI وسالي.

1. إعداد ترنسفكأيشن الصف بلازميد DNA من خلايا المختصة باستخدام QIAGEN بلازميد ميدي عدة.
2. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام معمل NanoDrop2000.

2. الارتجاعي الإنتاج

سيتم استخدام خط الخلية التعبئة والتغليف بلات-E لإنتاج الفيروس الارتجاعي ecotropic التي سيلقي [كدنا] التي تهم خلايا NIH 3T3.

1. إنشاء الثقافات بلات-E من خلايا مجمدة
   1. ذوبان الجليد بسرعة خلايا بلات-E في 37 ° C حمام الماء ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة ببطء 9 مل من بلات-E المتوسطة (دوlbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) + البنسلين والستربتوميسين).
   2. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
   3. اعادة تعليق الخلايا مع 10 مل من بلات-E متوسطة ونقل إلى صحن ثقافة 10 سم.
   4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ الحاضنة حتى تكون 80-90٪ متموجة (حوالي 2 أيام).
2. تقسيم الخلايا
   1. نضح المتوسطة ويغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
   2. إضافة 2 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA واحتضان لمدة 1 دقيقة في RT.
   3. فصل الخلايا عن طريق الإصبع والتنصت، وإضافة 10 مل من بلات-E المتوسطة، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
   4. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
   5. resuspend الخلايا مع 10 مل من بلات-E المتوسطة والبذور منها في أطباق جديدة في 1: 4-1: 6 التخفيفات.
3. بلات-E البذر وترنسفكأيشن
   1. البذور 2 × 10 ⁶خلايا لكل 10 سم صحن الثقافة باستخدام بلات-E وسيط وبدون أي المضادات الحيوية.
   2. احتضان الخلايا O / N في 37 ° C، 5٪ CO ₂ الحاضنة.
   3. اليوم التالي، ونقل 300 ميكرولتر من غروب-MEM إلى 1.5 مل microfuge أنبوب.
   4. إضافة 27 ميكرولتر من polyethylenimine (PEI)، وكاشف ترنسفكأيشن فعالة من حيث التكلفة ^12، إلى أنبوب استعداد مع غروب-MEM. المزيج بلطف بواسطة الإصبع التنصت واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
   5. إضافة 9 ميكروغرام من DNA البلازميد ترنسفكأيشن الصف في أنبوب غروب-MEM / PEI، مزيج من قبل vortexing بلطف، واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
   6. إضافة DNA / PEI قطرة من الحكمة معقدة في طبق بلات-E، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
   7. اليوم التالي، نضح في المتوسط ​​تحتوي على كاشف ترنسفكأيشن وإضافة 10 مل من جديد بلات-E متوسطة (بدون المضادات الحيوية).
   8. عودة إلى الخلايا الحاضنة.

3. خلايا NIH 3T3 والعدوى

1. إنشاء المعاهد الوطنية للصحة3T3 الثقافات والبذر
   1. ذوبان الجليد بسرعة خلايا NIH 3T3 في 37 ° C حمام الماء ونقل إلى أنبوب 15 مل. إضافة ببطء 9 مل من NIH 3T3 المتوسطة (DMEM + 10٪ FBS).
   2. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
   3. resuspend الخلايا مع 10 مل من NIH 3T3 المتوسطة ونقل إلى صحن ثقافة 10 سم.
   4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ الحاضنة. من المهم جدا أن الخلايا NIH 3T3 يتم الاحتفاظ دائما underconfluent (50-60٪)، كما تردد التحول التلقائي (وبالتالي مستويات القاعدية من تشكيل بؤر) يزيد مرة واحدة تصل إلى ثقافة confluency.
   5. البذور 3 × 10 ⁵ خلايا لكل 10 سم طبق واحتضان O / N للعدوى في اليوم التالي.
2. عدوى
   1. حصاد طاف فيروسات من الطبق بلات-E باستخدام 10 مل حقنة واحدة، وتصفية عليه من خلال 0.45 ميكرون حجم المسام النايلون مرشح غشاء، وتحويلها إلى 15 ملأنبوب.
   2. إضافة 10 مل من جديد بلات-E المتوسطة للخلايا (بدون المضادات الحيوية)، وإعادتها إلى الحاضنة.
   3. نضح المتوسطة من الطبق خلية NIH 3T3 للإصابة، وإضافة 5 مل من العادية المتوسطة NIH 3T3 و 5 مل من التي تحتوي على فيروس تصفيتها طاف.
   4. إضافة polybrene إلى الطبق بتركيز 6 ميكروغرام / مل.
   5. احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
   6. اليوم التالي، كرر الخطوات من 3.2.1 - 3.2.5 لجولة ثانية من العدوى.
   7. استبدال المتوسطة التي تحتوي على الفيروس مع منتظم المتوسطة NIH 3T3.
   8. السماح للخلايا NIH 3T3 لتنمو لمدة 2-3 أسابيع، لتحل محل المتوسطة حسب الضرورة. تحقق من التعبير عن بروتين الاهتمام من جانب التقليدي الكهربائي البروتين وطخة مناعية على لست] خلية كاملة من لوحات طبق الأصل.

4. تلطيخ والكمي

1. الكريستال البنفسجي تلطيخ
   1. نضح المتوسطة NIH 3T3 ووضع الأطباقعلى الجليد.
   2. غسل الأطباق مرتين مع PBS الجليد الباردة.
   3. إصلاح الخلايا مع الميثانول الجليد الباردة لمدة 10 دقيقة.
   4. إزالة أطباق من الجليد، ونضح الميثانول، وإضافة 3 مل من 0.5٪ محلول الكريستال البنفسجي المحرز في 25٪ الميثانول (RT).
   5. احتضان الأطباق لمدة 5 دقائق على RT.
   6. نضح الحل الكريستال البنفسجي وشطف بعناية الطبق مع ميلي-Q H ₂ O حتى يأتي لا لون ثماره في الشطف.
   7. السماح للأطباق لتجف O / N على الفوق (كشف).
2. بؤر الكمي
   1. مرة واحدة الأطباق جافة، استخدام مسطرة لقياس مجموعات الملونة على نحو مظلم من الخلايا على طبق من ذهب. الاعتماد فقط تلك التي هي أكبر من 5 ملم في القطر بأنها "بؤر". سجل عدد من البؤر وحساب المتوسطات وأهمية مقارنة مع الضوابط.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

MXD3 هو عامل النسخ الأساسي سحاب الحلزون حلقة حلزون ليسين (bHLHZ) الذي هو عضو من MYC / MAX / شبكة MAD. وهي عضو غير نمطية للأسرة MAD ^13-15، وأفيد أن تشارك في التسرطن ^16،17. بالمقارنة مع pBABEpuro (المراقبة السلبية) وMYC (مراقبة إيجابية)، كانت أطباق NIH 3T3 حيث تم overexpressed MXD3 أقل بكثير البؤ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يوفر FFA طريقة سريعة وسهلة لتقييم التحول الخبيث في المختبر. فمن قابلة للفحص عدد كبير نسبيا من الجينات المرشحة، والمتطلبات التقنية المتواضعة جعلها فعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، اثنين أو أكثر من الجينات يمكن coexpressed (يشار إليها أحيانا باسم "التعاون" فحص)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pBABE-puro vector	Addgene	Plasmid 1764	cloning vector
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	RV-101	cell line for viral production
NIH 3T3 Cell Line murine	Sigma-Aldrich	93061524	cell line for focus formation assay
10 ml BD Luer-Lok tip syringe	BD Biosciences	309604	viral production reagent
0.45 μm Puradisc Syringe Filter	Whatman	6750-2504	viral production reagent
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences, Inc.	23966-2	cell transfection reagent
Polybrene Infection / Transfection Reagent	EMD Millipore	TR-1003-G	cell transfection reagent
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	cell stain reagent
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	plasmid purification
BD Falcon Tissue Culture Dishes	BD Biosciences	353003	cell culture supplies
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	cell culture media
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	cell culture supplies
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985-062	cell culture media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044	cell culture media