להתמקד גיבוש: Assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של ג'ין

Summary

Assay גיבוש הפוקוס מספק שיטה פשוטה להעריך את הפוטנציאל להפוך לאונקוגן מועמד.

Abstract

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals¹. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)². When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci¹ that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

Introduction

ניתן להבחין בתאי גידול מעמיתיהם הרגילים על ידי מגוון רחב של שינויים, מדפוסי ביטוי גנים לepigenomics לשינויים מורפולוגיים ושגשוג. בקרב האחרון, הפחית את התלות בסרום, אובדן קשר עיכוב (צפיפות), הרכישה של התפשטות מעגן-עצמאי וסופו של דבר, את היכולת ליצור גידולים כאשר הוזרקו לבעלי חיים הם אינדיקטורים שימושיים, הניתנים למדידה של שינוי הממאיר ^3. כמה במבחנה ובמבחני vivo פותחו לשינוי סלולארי. במבחנה מבחני מכוונים לזיהוי ומדידת שינויים במורפולוגיה תרבות (assay היווצרות מוקד), דינמיקת התרבות (שיעור צמיחה, צפיפות רוויה) וגורם גדילה (צמיחה בסרום מופחת) או מעגן (צמיחה באגר רכה) דרישות. תקן הזהב לקביעת האופי הממאיר של סוג תא נשאר היווצרות גידול (xenografts) בחיות מעבדה. עם זאת, לאהוא יעלה ואורך של מחקרי in vivo לא תמיד להפוך אותם מוצדק כצעד ראשון אימות או הקרנה של אונקוגנים מועמד. למרות שאף assay במבחנה מספק הערכה ברורה של הפוטנציאל שבעור של גן, הם מספקים תובנה פוטנציאל שבעור שעשויה לצמצם את העתיד במחקרי vivo. אחת מהמערכות הנפוצות ביותר להערכת פוטנציאל סרטני במבחנה הוא Assay גיבוש הפוקוס ^2. גישה זו מסתמכת על השימוש בפיברובלסטים עכבר NIH 3T3, קו תאים לא שינה שמראה עיכוב קשר חזק. ביטוי יתר של תוצאות אונקוגן באובדן צמיחת צפיפות תלויה; תאים הופכים יכולים לגדול אז במספר שכבות, ויצרו "מוקדים", דמיינו בקלות נגד monolayer הרקע של תאים-שינה הלא. גיבוש הפוקוס Assay, אז, מודד את היכולת של אונקוגן מועמד לגרום לשינוי ממאיר, כפי שמעיד על אובדן inhib קשרition כפנוטיפ למדידה. FFA נעשה שימוש כדי להעריך שינוי בביטוי יתר של החלבון קינאז (למשל, ⁴ Src, BRAF ^5), גורמי שעתוק (למשל, N-myc ⁶⁾ קולטנים, G-מצמידים חלבון (לדוגמא, ⁷ P2RY8) וGTPases (למשל , ראס ^1), בין יתר. הקלות היחסית של assay זה הופכת אותו לבחירה טובה שתספק תשובה מהירה וחזותי ברורה אם ביטוי יתר של הגן די בכך כדי להפוך את תאי פיברובלסטים עכבר NIH 3T3 במבחנה.

FFA המתואר בפרוטוקול זה משתמש בקו Plat-E תא אריזה ^8, המספק חלבוני אריזה נגיפיים, וpBABEpuro retroviral הווקטור ⁹ (פלסמיד Addgene 1764) כדי לייצר רטרו-וירוס. לאחר transfection עם מבנה pBABEpuro המכיל את הגן של עניין, שורת תאי Plat-E תפיק רטרו-וירוס ecotropic שיכול לשמש כדי להדביק תאי NIH 3T3. Tהשיטה הנגיפית של מסירת הגן היא יעילה יותר מאשר שיטות transfection הכימי מסורתיות והיא מציעה דרך לבטא את הגן ^{10-קיימא.} התאגד ברגע שלתוך הגנום של תאי NIH 3T3, ביטוי יתר של הגן של עניין הוא מונע על ידי האמרגן חוזר מסוף ארוך הנגיפי (LTR) ^11. ביטוי קבוע זה יכול לשמש כדי לקבוע אם הגן של עניין יש לו פעילות שבעור, כפי שהיא נמדדת על ידי יצירת מוקדים, על תאי NIH 3T3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. ביצוע הווקטורים ויראליים

רצפי הקידוד עבור הגן של עניין, כמו גם בקרות החיוביות ושליליות, מוכנסים לתוך pBABEpuro על ידי שיטות מסורתיות שיבוט (PCR הגברה, עיכול הגבלה וקשירה). ישנם ארבעה אתרי הגבלה על הווקטור שבו ניתן להכניס את ה- DNA: BamHI, SnaBI, EcoRI וסאלי.

1. הכן את ה- DNA פלסמיד כיתה transfection מהתאים מוסמכים באמצעות ערכת midi פלסמיד QIAGEN.
2. למדוד ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop2000.

2. רטרו-וירוס הפקה

קו תא אריזת Plat-E ישמש להפקת רטרו-וירוס ecotropic שיספוק את cDNA של עניין לתאי NIH 3T3.

1. הקמת תרבויות Plat-E מ תאים קפואים
   1. במהירות להפשיר תאי Plat-E באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהעביר צינור חרוטי 15 מיליליטר. לאט לאט להוסיף 9 מיליליטר של מדיום Plat-E (Duהנשר בינוני של lbecco שונה (DMEM) + 10% שור עוברי סרום (FBS) + פניצילין וסטרפטומיצין).
   2. צנטריפוגות הצינור ב 180 x גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant.
   3. להשעות מחדש את התאים עם 10 מיליליטר של מדיום Plat-E והעברה לצלחת תרבות 10 סנטימטרים.
   4. דגירה התאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור עד שהם% ומחוברות 80-90 (כ 2 ימים).
2. פיצול תא
   1. לשאוב את המדיום ולשטוף תאי פעם עם PBS.
   2. הוסף 2 מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA דגירה דקות 1 ב RT.
   3. לנתק את התאים על ידי הקשה על אצבע, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום Plat-E, ולהעביר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר.
   4. צנטריפוגות הצינור ב 180 x גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant.
   5. Resuspend התאים עם 10 מיליליטר של מדיום Plat-E וזרעם במנות חדשות ב1: 4-1: 6 דילולים.
3. Plat-E זריעה וTransfection
   1. זרע 2 x 10 ⁶תאים לכל צלחת תרבות 10 סנטימטרים באמצעות מדיום Plat-E ללא כל אנטיביוטיקה.
   2. דגירה התאים O / N ב37 ° C, חממה 5% CO _2.
   3. למחרת, להעביר 300 μl של Opti-ממ לתוך צינור 1.5 מיליליטר microfuge.
   4. להוסיף 27 μl של polyethylenimine (PEI), מגיב transfection חסכוני ^12, אל הצינור מוכן עם Opti-MEM. מערבבים בעדינות על ידי הקשה על אצבע ודגירה של 5 דקות ב RT.
   5. הוסף 9 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד כיתה transfection לתוך צינור Opti-ממ / PEI, מערבב בעדינות על ידי vortexing, ודגירה במשך 15 דקות ב RT.
   6. מוסיף את ה- DNA / PEI ירידה מבחינת מורכבת לתוך צלחת Plat-E, ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   7. למחרת, לשאוב את המדיום המכיל את מגיב transfection ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום Plat-E הטרי (ללא אנטיביוטיקה).
   8. להחזיר את התאים לחממה.

3. תאי NIH 3T3 וזיהום

1. הקמת NIHתרבויות 3T3 וזריעה
   1. במהירות להפשיר תאי NIH 3T3 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהעביר לצינור 15 מיליליטר. לאט לאט להוסיף 9 מיליליטר של מדיום NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS).
   2. צנטריפוגות הצינור ב 180 x גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant.
   3. Resuspend התאים עם 10 מיליליטר של מדיום NIH 3T3 והעברה לצלחת תרבות 10 סנטימטרים.
   4. דגירה התאים ב37 ° C, חממה 5% CO _2. זה מאוד חשוב כי תאי NIH 3T3 תמיד נשמרים underconfluent (50-60%), כתדר של שינוי ספונטני (ולכן רמות בסיסיות של היווצרות מוקדים) מגביר פעם בתרבות מגיעה confluency.
   5. זרע 3 x 10 ⁵ תאים לכל צלחת 10 סנטימטרים ודגירת O / N לזיהום למחרת.
2. זיהום
   1. קציר supernatant retroviral מצלחת Plat-E באמצעות מזרק חד פעמי מיליליטר 10, סינונו דרך מסנן קרום ניילון גודל 0.45 מיקרומטר נקבובית, והעברתו ל-15 מיליליטרצינור.
   2. הוסף 10 מיליליטר של מדיום Plat-E הטרי לתאים (ללא אנטיביוטיקה), ולהחזיר אותם לחממה.
   3. לשאוב את המדיום מצלחת תא NIH 3T3 להיות נגועות, ולהוסיף 5 מיליליטר של מדיום NIH 3T3 רגיל ו -5 מיליליטר של supernatant המסונן המכיל וירוס.
   4. להוסיף polybrene לצלחת בריכוז של 6 מיקרוגרם / מיליליטר.
   5. דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   6. למחרת, חזור על השלבים 3.2.1 - 3.2.5 לסיבוב שני של זיהום.
   7. החלף את המדיום המכיל וירוס עם מדיום NIH 3T3 רגיל.
   8. אפשר תאי NIH 3T3 לגדול במשך 2-3 שבועות, החלפה הבינוני במידת צורך. בדוק ביטוי של החלבון של עניין על ידי אלקטרופורזה הקונבנציונלית החלבון וimmunoblot על lysates תא שלם מצלחות העתק.

4. מכתים וכימות

1. קריסטל ויולט מכתים
   1. לשאוב את מדיום NIH 3T3 ולמקם את הכליםעל קרח.
   2. לשטוף הכלים פעמיים עם PBS קר כקרח.
   3. תקן את התאים עם מתנול קר כקרח במשך 10 דקות.
   4. הסר את המנות מהקרח, לשאוב מתנול, ולהוסיף 3 מיליליטר של 0.5% פתרון סגול גביש עשה ב 25% מתנול (RT).
   5. דגירה המנות במשך 5 דקות בRT.
   6. לשאוב את הפתרון סגול גביש ולשטוף היטב את המנה עם מילי- Q H ₂ O עד שלא צבע יורד בשטיפה.
   7. לאפשר את הכלים לייבוש O / N בbenchtop (שנחשף).
2. כימות מוקדים
   1. ברגע שהמנות יבשות, להשתמש בסרגל למדוד את האוספים צבעוניים הכהה של תאים על הצלחת. לספור רק את אלה שהם יותר מ 5 מ"מ בקוטר כ" מוקדים ". רשום את מספר המוקדים ולחשב ממוצעים והמשמעות בהשוואה לקבוצת הביקורת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

MXD3 הוא גורם שעתוק הרוכסן לאוצין סליל לולאה, סליל בסיסי (bHLHZ) שהוא חבר של MYC / מקס / רשת MAD. זה חבר טיפוסי של משפחת MAD ^13-15, וזה כבר דיווח להיות מעורב בהיווצרות הסרטן ^16,17. בהשוואה לpBABEpuro (בקרה שלילית) וMYC (ביקורת חיובית), היו מנות NIH 3T3 בי MXD3 היה ביטוי יתר באופן משמעותי ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

FFA מספק שיטה קלה ומהירה כדי להעריך שינוי ממאיר במבחנה. זה ניתן להקרנה של מספר גדול יחסית של גני מועמדים, והדרישות הטכניות הצנועים שלה לעשות את זה יעיל וחסכוני. יתר על כן, ניתן coexpressed שתיים או יותר גנים (המכונה לעתים assay "שיתוף פעולה") כדי להעריך את הפוטנציאל הסר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pBABE-puro vector	Addgene	Plasmid 1764	cloning vector
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	RV-101	cell line for viral production
NIH 3T3 Cell Line murine	Sigma-Aldrich	93061524	cell line for focus formation assay
10 ml BD Luer-Lok tip syringe	BD Biosciences	309604	viral production reagent
0.45 μm Puradisc Syringe Filter	Whatman	6750-2504	viral production reagent
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences, Inc.	23966-2	cell transfection reagent
Polybrene Infection / Transfection Reagent	EMD Millipore	TR-1003-G	cell transfection reagent
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	cell stain reagent
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	plasmid purification
BD Falcon Tissue Culture Dishes	BD Biosciences	353003	cell culture supplies
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	cell culture media
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	cell culture supplies
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985-062	cell culture media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044	cell culture media