Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

Riepilogo

Il saggio Formazione Focus fornisce un metodo semplice per valutare il potenziale di trasformare un oncogene candidato.

Abstract

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals¹. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)². When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci¹ that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

Introduzione

Le cellule tumorali possono essere distinti dalle loro controparti normali da una vasta gamma di alterazioni, dai modelli di espressione genica per epigenomica ai cambiamenti morfologici e proliferativi. Tra questi ultimi, ridotta dipendenza da siero, perdita di contatto (densità) inibizione, l'acquisizione della proliferazione di ancoraggio-indipendente e, in ultima analisi, la capacità di formare tumori quando iniettate in animali sono utili, indicatori misurabili di trasformazione maligna ^3. Diversi in vitro e in vivo sono stati sviluppati per la trasformazione cellulare. In vitro mirare a individuare e cambiamenti nella cultura morfologia (attenzione test formazione), la dinamica della cultura (il tasso di crescita, la densità di saturazione) e fattore di crescita di misura (la crescita nel siero ridotta) o ancoraggio (crescita in soft agar) esigenze. Il gold standard per determinare la natura maligna di un tipo di cellula rimane la formazione di tumori (xenotrapianti) negli animali da esperimento. Tuttavia, tl costo e la durata degli studi in vivo non sempre li rendono giustificabile in una prima fase di validazione o proiezione di oncogeni candidati. Anche se nessun test in vitro fornisce una valutazione definitiva del potenziale oncogeno di un gene, essi forniscono informazioni in potenziale oncogeno che potrebbero restringere futuro studi in vivo. Uno dei sistemi più utilizzati per valutare il potenziale oncogeno in vitro è al centro di Formazione Assay ^2. Questo approccio si basa sull'uso di NIH 3T3 fibroblasti di topo, una linea cellulare non trasformato che mostra forte inibizione contatto. Sovraespressione di un oncogene si traduce in perdita di crescita di densità-dipendente; cellule trasformate possono crescere in strati multipli, formando "fuochi", facilmente visualizzato sullo sfondo monostrato di cellule non trasformate. La formazione fuoco Assay, poi, misura la capacità di un oncogene candidato per indurre la trasformazione maligna, come dimostra la perdita di contatto inibition come un fenotipo misurabile. L'FFA è stato utilizzato per valutare la trasformazione da sovraespressione di proteine ​​chinasi (ad esempio, Src ^4, BRAF ^5), fattori di trascrizione (ad esempio, N-myc ⁶⁾ recettori, G-accoppiati alle proteine ​​(ad esempio, P2RY8 ⁷⁾ e GTPases (ad esempio, , Ras ^1), tra gli altri. La relativa facilità di questo saggio rende una buona scelta che fornirà una risposta rapida e visivamente chiaro se sovraespressione del gene è sufficiente per trasformare cellule di fibroblasti di topo NIH 3T3 in vitro.

L'FFA descritto in questo protocollo utilizza la linea cellulare di confezionamento Plat-E ^8, che fornisce proteine ​​virali di imballaggio, e il vettore retrovirale pBABEpuro ⁹ (Addgene plasmide 1764) per la produzione di retrovirus. Dopo trasfezione con il costrutto pBABEpuro contenente il gene di interesse, la linea cellulare Plat-E produrrà retrovirus ecotropic che può essere utilizzato per infettare cellule NIH 3T3. Til suo metodo virale di consegna del gene è più efficiente rispetto ai metodi di trasfezione chimici tradizionali e offre un modo per esprimere in modo sostenibile il gene ^10. Una volta inseriti nel genoma delle cellule NIH 3T3, sovraespressione del gene di interesse è guidato dalla lunghe ripetizioni terminali virali (LTR) promotore ^11. Questa costante espressione può essere usato per determinare se il gene di interesse ha attività oncogenica, come misurato dalla formazione di foci, sulle cellule NIH 3T3.

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Protocollo

1. Rendere i vettori virali

Le sequenze codificanti per il gene di interesse, così come i controlli positivi e negativi, sono inseriti in pBABEpuro con metodi tradizionali di clonazione (amplificazione PCR, digestione di restrizione e legatura). Ci sono quattro siti di restrizione sul vettore in cui il DNA può essere inserito: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sali.

1. Preparare trasfezione-grade plasmide DNA dalle cellule competenti mediante il kit plasmide midi QIAGEN.
2. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop2000.

2. Retrovirus Produzione

La linea cellulare di packaging Plat-E sarà utilizzato per produrre retrovirus ecotropic che porterà il cDNA di interesse per cellule NIH 3T3.

1. Stabilire Plat-E culture di cellule congelate
   1. Scongelare rapidamente cellule Plat-E in un bagno d'acqua ° C 37 e trasferire in una provetta da 15 ml. Lentamente aggiungere 9 ml di Plat-E medio (Dudi lbecco modificato (DMEM) + 10% siero fetale bovino (FBS) + penicillina e streptomicina).
   2. Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
   3. Risospendere le cellule con 10 ml di Plat-E a medio e trasferimento in un piatto di cultura 10 cm.
   4. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore fino a quando sono 80-90% confluenti (circa 2 giorni).
2. Splitting cellulare
   1. Aspirare il medio e lavare le cellule una volta con PBS.
   2. Aggiungere 2 ml di 0,05% tripsina-EDTA e incubare per 1 min a RT.
   3. Staccare le cellule finger tapping, aggiungere 10 ml di Plat-E di media, e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml.
   4. Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
   5. Risospendere le cellule con 10 ml di Plat-E a medio e sementi in nuovi piatti a 1: 4-1: 6 diluizioni.
3. Plat-E Seeding e Transfection
   1. Seed 2 x 10 ⁶cellule per 10 centimetri piatto di coltura usando Plat-E medio senza antibiotici.
   2. Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
   3. Il giorno dopo, il trasferimento di 300 ml di Opti-MEM in 1,5 ml provetta da microcentrifuga.
   4. Aggiungere 27 ml di polyethylenimine (PEI), un costo-efficacia di trasfezione reattivo ^12, al tubo preparato con Opti-MEM. Mescolare delicatamente con le dita toccando e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Aggiungere 9 mg di trasfezione-grade plasmide DNA nel tubo Opti-MEM / PEI, mescolare delicatamente con il vortex e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
   6. Aggiungere il DNA / PEI goccia a goccia complesso nel piatto Plat-E, e incubare O / N a 37 ° C, 5% CO _2.
   7. Il giorno dopo, aspirare il supporto contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 10 ml di fresco medio Plat-E (senza antibiotici).
   8. Riportare le cellule per l'incubatore.

3. Cellule NIH 3T3 e infezioni

1. Stabilire NIHCulture 3T3 e il seeding
   1. Scongelare rapidamente cellule NIH 3T3 in ° C bagnomaria 37 e trasferire in una provetta da 15 ml. Aggiungere lentamente 9 ml di NIH 3T3 medium (DMEM + 10% FBS).
   2. Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
   3. Risospendere le cellule con 10 ml di NIH 3T3 media e il trasferimento ad un piatto di cultura 10 cm.
   4. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore. È molto importante che le cellule NIH 3T3 sono sempre tenute underconfluent (50-60%), la frequenza di trasformazione spontanea (e quindi i livelli basali di formazione foci) aumenta una volta coltura raggiunga confluenza.
   5. Seed 3 x 10 ⁵ cellule per 10 centimetri piatto e incubare O / N per l'infezione il giorno successivo.
2. Infezione
   1. Raccogliere il supernatante retrovirale dal piatto Plat-E utilizzando una siringa monouso 10 ml, filtrare attraverso un filtro a membrana di nylon dimensioni 0,45 micron pori, e trasferirlo in un 15 mltube.
   2. Aggiungere 10 ml di fresco medio Plat-E per le cellule (senza antibiotici), e restituirli alla incubatrice.
   3. Aspirare il supporto dal piatto delle cellule NIH 3T3 di essere infetti, e aggiungere 5 ml di regolare medie NIH 3T3 e 5 ml di virus contenenti surnatante filtrato.
   4. Aggiungere polibrene al piatto ad una concentrazione di 6 mg / ml.
   5. Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO _2.
   6. Il giorno dopo, ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.5 per un secondo turno di infezione.
   7. Sostituire il supporto contenente il virus, con regolare medio NIH 3T3.
   8. Lasciare le cellule NIH 3T3 a crescere per 2-3 settimane, sostituendo la soluzione, se necessario. Controllare espressione della proteina di interesse mediante elettroforesi delle proteine ​​convenzionale e immunoblot su lisati cellulari interi da lastre di replica.

4. Colorazione e quantificazione

1. Cristallo viola colorazione
   1. Aspirare il mezzo di NIH 3T3 e posizionare i piattisul ghiaccio.
   2. Lavare i piatti due volte con PBS freddo.
   3. Fissare le cellule con metanolo ghiacciata per 10 min.
   4. Togliere i piatti da ghiaccio, aspirare il metanolo, e aggiungere 3 ml di soluzione di cristallo viola 0,5% effettuati nel 25% di metanolo (RT).
   5. Incubare i piatti per 5 minuti a RT.
   6. Aspirare la soluzione a cristalli viola e risciacquare accuratamente il piatto con Milli-Q H ₂ O fino a quando nessun colore si stacca nel risciacquo.
   7. Lasciare i piatti asciugare O / N su un banco (scoperto).
2. Foci Quantificazione
   1. Una volta che i piatti sono asciutti, utilizzare un righello per misurare le collezioni di colore scuro di cellule sulla piastra. Contano solo quelli che sono più di 5 mm di diametro come "focolai". Registrare il numero di focolai e calcolare le medie e il significato rispetto ai controlli.

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Risultati

MXD3 è un fattore fondamentale cerniera elica-ansa-elica leucina (bHLHZ) di trascrizione che è un membro del MYC / MAX / network MAD. Si tratta di un atipico membro della famiglia MAD ^13-15, ed è stato segnalato per essere coinvolti nella carcinogenesi ^16,17. Rispetto al pBABEpuro (controllo negativo) e MYC (controllo positivo), i piatti NIH 3T3 dove era sovraespresso MXD3 era significativamente inferiore foci (Figura 1A). I dati della figura 1B sono stati racco...

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Discussione

La FFA fornisce un metodo semplice e veloce per valutare trasformazione maligna in vitro. E 'suscettibile di proiezione di un numero relativamente elevato di geni candidati, e le sue esigenze tecniche modeste rendono conveniente. Inoltre, due o più geni possono essere coexpressed (talvolta indicato come un saggio "cooperazione") per valutare il potenziale cancerogeno della combinazione. I vantaggi di questo test si basano sulla sua tecnica semplice, la facilità di quantificazione e la sua relati...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
pBABE-puro vector	Addgene	Plasmid 1764	cloning vector
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	RV-101	cell line for viral production
NIH 3T3 Cell Line murine	Sigma-Aldrich	93061524	cell line for focus formation assay
10 ml BD Luer-Lok tip syringe	BD Biosciences	309604	viral production reagent
0.45 μm Puradisc Syringe Filter	Whatman	6750-2504	viral production reagent
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences, Inc.	23966-2	cell transfection reagent
Polybrene Infection / Transfection Reagent	EMD Millipore	TR-1003-G	cell transfection reagent
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	cell stain reagent
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	plasmid purification
BD Falcon Tissue Culture Dishes	BD Biosciences	353003	cell culture supplies
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	cell culture media
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	cell culture supplies
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985-062	cell culture media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044	cell culture media