フォーカス形成：細胞ベースのアッセイ遺伝子の発癌性を決定するために、

要約

フォーカス形成アッセイは、候補癌遺伝子の形質転換能を評価するための簡単​​な方法を提供する。

要約

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals¹. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)². When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci¹ that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

概要

腫瘍細胞は、遺伝子発現のパターンの形態学的および増殖性の変化にエピゲノミクスに、変化の広い範囲によってそれらの正常な対応物と区別することができる。後者の中では、、、接触の損失（密度）阻害を血清への依存を軽減足場非依存性増殖の取得と、最終的には、動物に注射した場合に腫瘍を形成する能力は、悪性形質転換³の有効、測定可能な指標である。 in vitroおよびin vivoアッセイにおけるいくつかの細胞の形質転換のために開発されてきた。 インビトロアッセイは、（成長速度、飽和密度）及び増殖因子（低血清成長）、培養形態（フォーカス形成アッセイ）の変化を識別し、測定時に培養ダイナミクスを目指すまたは要件アンカレッジ（ソフトアガーでの成長）。細胞型の悪性の性質を決定するためのゴールドスタンダードは、実験動物における腫瘍形成（異種移​​植片）のままである。しかし、T彼は、コストとのインビボ研究の長さは、常に候補癌遺伝子の最初の検証ステップまたはスクリーニング、それらに正当ことはありません。何のin vitroアッセイは、遺伝子の発癌性の明確な評価を提供していないが、これらは、生体内の研究で未来を絞り込むことが発癌性への洞察を提供します。 インビトロでの発癌性を評価するための最も広く使用されているシステムの一つはフォーカス形成アッセイ²である。このアプローチは、NIH 3T3マウス線維芽細胞、強く接触阻害を示し、非形質転換細胞株の使用に依存している。密度依存性増殖の損失の癌遺伝子の過剰発現。形質転換された細胞は、次に簡単に非形質転換細胞のバックグラウンド単層に対して可視化「病巣」を形成する、複数の層で成長することができる。フォーカス形成アッセイは、その後、コンタクトInhibが喪失によって証明されるように、悪性形質転換を誘導する候補癌遺伝子の能力を測定する測定可能な表現型としてition。 FFAは、プロテインキナーゼ（ 例えば 、Srcの^{4、BRAF 5）}の過剰発現により形質転換を評価するために使用されている、転写因子（ 例えば 、N-mycの^6）、Gタンパク質共役受容体（ 例えば 、P2RY8 ^7）およびGTPアーゼ（ 例えばとりわけラス^1）。このアッセイの相対的な容易さは、遺伝子の過剰発現は、インビトロで NIH 3T3マウス線維芽細胞を形質転換するのに十分であるか否かを迅速かつ視覚的に明確な答えを提供する適切な選択肢となる。

FFAは、このプロトコルに記載のレトロウイルスを産生するウイルスパッケージングタンパク質を提供するのPlat-Eパッケージング細胞株^8、およびレトロウイルスベクターpBABEpuro ^9（Addgeneプラスミド1764）を使用する。目的の遺伝子を含むpBABEpuro構築物でトランスフェクションした後、のPlat-E細胞株は、NIH 3T3細胞を感染させるために使用することができるエコトロピックレトロウイルスを産生する。 T遺伝子送達の彼のウイルスの方法は、従来の化学的なトランスフェクション法よりも効率的であり、それは持続的に遺伝子^10を表現する方法を提供しています。 NIH 3T3細胞のゲノムに組み込まれると、目的の遺伝子の過剰発現は、ウイルスの長い末端反復（LTR）プロモーター¹¹によって駆動される。この定数式は、NIH 3T3細胞に、病巣の形成によって測定されるように、目的の遺伝子は、発癌活性を有するかどうかを決定するために使用することができる。

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プロトコル

1.ウイルスベクターを作る

目的の遺伝子、ならびに陽性および陰性対照のためのコード配列は、従来のクローニング法（PCR増幅、制限消化およびライゲーション）によってpBABEpuroに挿入される。 BamHIでSnaBIで、EcoRIおよびSalIで：DNAを挿入することができるベクター上の4つの制限部位がある。

1. QIAGENプラスミドミディキットを使用してコンピテント細胞からトランスフェクショングレードのプラスミドDNAを準備します。
2. NanoDrop2000分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。

2.レトロウイルス生産

のPlat-Eパッケージング細胞株は、NIH 3T3細胞に目的のcDNAを送達するエコトロピックレトロウイルスを産生するために使用される。

1. 凍結細胞からのPlat-Eの文化の確立
   1. すぐに37℃の水浴中でのPlat-E細胞を解凍し、15mlのコニカルチューブに移す。ゆっくりとのPlat-E培地9ml（デュを追加lbecco改変イーグル培地（DMEM）+ 10％ウシ胎児血清（FBS）+ペニシリン及びストレプトマイシン）。
   2. 180 xでのチューブを遠心 gで5分間、上清を捨てる。
   3. 再懸濁のPlat-E培地及び10cmの培養皿に移し、10 mlの細胞。
   4. それらは80〜90％コンフルエント（約2日）になるまで37℃、5％CO ₂インキュベーター中で細胞をインキュベートする。
2. セル分割
   1. メディアを吸引除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。
   2. 0.05％トリプシンEDTAの2ミリリットルを加え、室温で1分間インキュベートする。
   3. 指タッピングによって細胞を剥離、ぷらっと-E培地10mlを追加し、15ミリリットルチューブに細胞懸濁液を移す。
   4. 180 xでのチューブを遠心 gで5分間、上清を捨てる。
   5. ぷらっと-E培地10mlで細胞を再懸濁し、1から新しい料理でそれらをシード：4-1：6の希釈。
3. PLAT-Eシードおよびトランスフェクション
   1. シード2×10 ⁶任意の抗生物質を含まないのPlat-E培地を用いて10cmの培養皿当たり細胞。
   2. 37℃、5％CO ₂インキュベーター中で細胞をO / Nでインキュベートする。
   3. 翌日、1.5mlマイクロチューブにのOpti-MEM300μlのを転送する。
   4. のOpti-MEMでプリペアチューブに、ポリエチレンイミンの27μL（PEI）、費用対効果の高いトランスフェクション試薬^12を追加します。指タッピングにより穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートする。
   5. 、のOpti-MEM / PEIチューブにトランスフェクショングレードのプラスミドDNAの9μgのを追加し、ボルテックスにより穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートする。
   6. 追加DNA / PEIのPlat-E皿に、37℃でO / Nインキュベート複雑なワイズドロップ、5％のCO _2。
   7. 翌日、トランスフェクション試薬を含む培地を吸引し、（抗生物質を含まない）新鮮なのPlat-E培地10mlを追加します。
   8. インキュベーターにセルを返します。

3. NIH 3T3細胞と感染

1. NIHの確立3T3文化や播種
   1. すぐに37℃の水浴中でNIH 3T3細胞を解凍し、15mlチューブに移す。ゆっくりとNIH 3T3培地（DMEM + 10％FBS）の9ミリリットルを追加します。
   2. 180 xでのチューブを遠心 gで5分間、上清を捨てる。
   3. 10cmの培養皿にNIH 3T3媒体と転送10mlで細胞を再懸濁。
   4. 37℃、5％CO ₂インキュベーター中で細胞をインキュベートする。これは、自発的な変換（および病巣形成の、したがって基礎レベル）の周波数として文化がコンフルエントに達すると増加、NIH 3T3細胞は常にunderconfluent（百分の50から60）を保持していることが非常に重要です。
   5. シード3×10 10 cmディッシュあたり^5個の細胞と、翌日感染のためにO / Nインキュベートする。
2. 感染
   1. 孔径0.45μmのナイロン膜フィルターを介して濾過する10mlの使い捨てシリンジを使用し、そして15mlにそれを転送することによってのPlat-E皿からレトロウイルス上清を収穫チューブ。
   2. （抗生物質を含まない）を細胞に新鮮なのPlat-E培地10mlを追加し、インキュベーターに戻す。
   3. 感染していることがNIH 3T3細胞ディッシュから培地を吸引し、ウイルス含有濾過した上清の5の正規NIH 3T3培地1mlと5ミリリットルを追加します。
   4. 610μg/ mlの濃度で、皿にポリブレンを追加します。
   5. 37℃、5％CO ₂で細胞をO / Nでインキュベートする。
   6. 感染の第二ラウンドのために3.2.5 - 次の日、繰り返して3.2.1を繰り返します。
   7. 定期的なNIH 3T3培地でウイルス含有培地を交換してください。
   8. NIH 3T3細胞は、必要に応じて培地を交換、2-3週間成長できるようにします。レプリカプレートから全細胞溶解物に従来のタンパク質電気泳動およびイムノブロットにより、目的のタンパク質の発現を確認してください。

4.染色および定量

1. クリスタルバイオレット染色
   1. NIH 3T3培地を吸引し、食器を置く氷の上で。
   2. 氷冷PBSで2回皿を洗う。
   3. 10分間氷冷メタノールで細胞を固定します。
   4. 氷から皿を外し、メタノールを吸引し、25％のメタノール（RT）で行われた、0.5％クリスタルバイオレット溶液の3ミリリットルを追加します。
   5. RTで5分間皿をインキュベートする。
   6. クリスタルバイオレット溶液を吸引し、色がリンスに外れなくなるまで注意深くのMilli-Q H ₂ Oとの皿をすすぐ。
   7. 料理はベンチトップ（発見）にO / Nを乾燥することができます。
2. 病巣の定量
   1. 料理が乾燥したら、プレート上の細胞の暗色コレクションを測定するために定規を使用しています。として、直径5ミリメートルよりも大きくされているもののみをカウント "巣"を病巣の数を記録し、対照と比較して平均値と有意性を計算。

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結果

MXD3は、MYC / MAX / MADネットワークのメンバーである塩基性ヘリックス - ループ - ヘリックスロイシンジッパー（bHLHZ）転写因子である。それは、MADファミリー^13-15の異型メンバーであり、発癌^16,17に関与することが報告されている。 pBABEpuro（陰性対照）およびMYC（陽性対照）と比較した場合、MXD3を過剰発現させたNIH 3T3料理が著しく少ない病巣（ 図1A）を有してい?...

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ディスカッション

FFAは、in vitroでの悪性形質転換を評価するための迅速かつ容易な方法を提供する。これは、候補遺伝子の比較的多数のスクリーニングに適用され、その控えめな技術的要件は、費用対効果を高める。さらに、2つ以上の遺伝子を共発現させることができる組み合わせの腫瘍形成能を評価するために（時には「協力」アッセイと呼ばれる）。このアッセイの利点は、その単純な手法、定量...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pBABE-puro vector	Addgene	Plasmid 1764	cloning vector
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	RV-101	cell line for viral production
NIH 3T3 Cell Line murine	Sigma-Aldrich	93061524	cell line for focus formation assay
10 ml BD Luer-Lok tip syringe	BD Biosciences	309604	viral production reagent
0.45 μm Puradisc Syringe Filter	Whatman	6750-2504	viral production reagent
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences, Inc.	23966-2	cell transfection reagent
Polybrene Infection / Transfection Reagent	EMD Millipore	TR-1003-G	cell transfection reagent
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	cell stain reagent
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	plasmid purification
BD Falcon Tissue Culture Dishes	BD Biosciences	353003	cell culture supplies
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	cell culture media
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	cell culture supplies
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985-062	cell culture media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044	cell culture media