Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

Özet

Odak Oluşumu Testi aday onkogen dönüşürken potansiyelini değerlendirmek için basit bir yöntem sağlar.

Özet

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals¹. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)². When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci¹ that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

Giriş

Tümör hücrelerinin gen ifadesi örnekleri morfolojik ve proliferatif değişikliklere epigenomics için, değişiklik geniş bir yelpazesi ile, bunların normal emsallerine ayırt edilebilir. Sonuncular içinde, sonuç olarak, hayvanlara enjekte edildiğinde tümör oluşturma yeteneği habis dönüşüm ³ yararlı ölçülebilir göstergeleri, serum bağımlılığı, kontak (yoğunluğu) inhibisyonu kaybı, ankoraj-bağımsız çoğalma satın azalır ve. In vitro ve in vivo tahliller çeşitli hücresel transformasyon için geliştirilmiştir. In vitro deneyler, amaç (düşük serumda büyümesi) belirlenmesi ve kültür morfolojisi (odak oluşumu testi), kültür dinamiği (büyüme oranı, doygunluk yoğunluk) ve büyüme faktörü değişiklikleri ölçülmesi veya gereksinimleri ankraj (yumuşak agar büyüme). Bir hücre tipi malign tabiatını tespit etmek için altın standart deney hayvanlarında tümör formasyonu (ksenogrefleri) kalır. Bununla birlikte, TO mal ve in vivo çalışmalar uzunluğu her zaman aday onkojenlerin ilk doğrulama adımı veya tarama gibi onları haklı yapmazlar. Hiçbir in vitro deney, bir genin onkojenik potansiyeli kesin bir değerlendirmesini sağlar rağmen, onlar in vivo çalışmalar geleceği daraltmak olabilir onkojenik potansiyeli içgörü sağlarlar. In vitro onkojenik potansiyeli değerlendirmek için en yaygın kullanılan sistemlerden biri Odak Oluşumu Testi ^2. Bu yaklaşım, NIH 3T3 fare fibroblast, mutlaka temas inhibisyonu gösteren bir dönüştürülmemiş hücre çizgisinin kullanımına dayanır. Yoğunluk bağımlı büyüme kaybına bir onkogen sonuçların aşırı ekspresyonu; Dönüştürülen hücreler daha sonra kolayca dönüştürülmemiş hücrelerin arka plan tek tabaka ile görselleştirildi "odak" oluşturan, çok sayıda tabaka halinde büyüyebilir. İletişim inhib kaybı ile kanıtlandığı gibi odak oluşumu Deneyi, daha sonra, habis dönüşümünün uyarılması için aday onkogen kabiliyetini ölçmektedirölçülebilir fenotip olarak yerleştirme. FFA (örneğin, Src ⁴ BRAF ^5), protein kinazların aşırı ekspresyonu, transkripsiyon faktörleri (örneğin, N-myc ⁶⁾ (örneğin, P2RY8 ^7), G-protein bağlı reseptörler ve GTPazlar (örneğin, dönüşümün değerlendirmek için kullanılmıştır Ras ^1), ve diğerleri. Bu deneyde göreli kolaylığı genin ekspresyonu in vitro NIH 3T3 fare fibroblast hücrelerini dönüştürmek için yeterli olup olmadığı hızlı ve görsel net bir cevap verecek iyi bir seçim yapar.

Bu protokol açıklanan FFA viral ambalaj proteinleri sağlar Plat-E ambalaj hücre hattı ^8, kullanır ve retroviral vektörü pBABEpuro ⁹ (Addgene plazmid 1764) retrovirüs üretmek. İlgi konusu geni içeren pBABEpuro yapısı ile transfeksiyondan sonra Plat-D hücre çizgisi NIH 3T3 hücreleri enfekte etmek için kullanılabilir ekotropik retrovirüs üretecektir. TGen teslim onun viral yöntem, geleneksel kimyasal transfeksiyon yöntemlere göre daha etkili olduğunu ve sürdürülebilir geni ¹⁰ ifade etmek için bir yol sunar. Bir kez NIH 3T3 hücrelerinin genomu içine dahil edilmiş, ilgi konusu genin aşın virüs uzun terminal tekrarları (LTR) promoteri ¹¹ tarafından tahrik edilir. Bu sabit ifade eden NIH 3T3 hücreleri üzerinde odaklarının oluşumu ile ölçüldüğü haliyle ilgi konusu genin onkojenik etkinliğe sahip olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Viral vektörlerin yapımına

İlgi konusu genin, hem de pozitif ve negatif kontroller için kodlama dizileri, geleneksel klonlama (PCR amplifikasyonu, sınırlama sindirimi ve ligasyon) ile pBABEpuro sokulur. BamHI, SnaBI, EcoRI ve SalI: DNA ilave edilebilir vektör üzerindeki dört kısıtlama bölgeleri vardır.

1. QIAGEN plazmit Midi Kit kullanılarak yetkili hücrelerin transfeksiyonu dereceli plazma DNA hazırlanır.
2. Bir NanoDrop2000 spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçümü.

2. Retrovirus Üretimi

Plat-E, paketleme hücre soyu NIH 3T3 hücreleri ilgilendiren cDNA teslim edecek ekotropik retrovirüs üretmek için kullanılır.

1. Dondurulmuş Hücreleri Plat-e Kültürler kurulması
   1. Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde Plat-E hücreler eritin ve 15 ml konik tüp aktarın. Yavaş yavaş (Du Plat-E orta 9 ml ekleyinlbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS) + penisilin ve streptomisin).
   2. 180 x tüp santrifüj g 5 dakika ve süpernatan atılır.
   3. 10 cm kültür çanak Plat-E orta ve transfer 10 ml hücreleri yeniden askıya.
   4. Bunlar% 80-90 ortak akışlı (yaklaşık 2 gün) kadar 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatörü içinde inkübe hücreleri.
2. Hücre Bölme
   1. Orta aspire ve bir kez PBS ile yıkayın hücreleri.
   2. % 0.05 tripsin-EDTA 2 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin.
   3. , Dokunarak parmak hücreleri ayırmak Plat-E orta 10 ml ekleyin ve 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın.
   4. 180 x tüp santrifüj g 5 dakika ve süpernatan atılır.
   5. Plat-D ortamı 10 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve 1 yeni yemekler bunları tohum: 4-1: 6 dilüsyonları.
3. Plat-E Tohumlama ve Transfeksiyon
   1. Tohum, 2 x 10 ⁶Herhangi bir antibiyotik olmadan Plat-E ortamı kullanılarak 10 cm kültür çanak başına hücreleri.
   2. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatöründe hücreleri O / N inkübe edin.
   3. Ertesi gün, her 1.5 ml mikrofüj tüpüne Opti-MEM içinde 300 ul aktarın.
   4. Opti-MEM ile hazırlanan bir tüpe, polietilenimin 27 ul (PEI), düşük maliyetli bir transfeksiyon ayıracı ¹² ekleyin. Dokunarak parmakla hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
   5. Opti-MEM / PEI tüp içine transfeksiyon dereceli plazmid DNA 9 ug ekle vorteks ile yavaşça karıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
   6. Ekle DNA / PEI Plat-E kabına ve 37 ° C'de O / N inkübe karmaşık bilge damla,% 5 CO _2.
   7. Bir sonraki gün, transfeksiyon reaktifi ihtiva eden bir ortam aspire ve (antibiyotikler olmadan) taze Plat-D ortamı 10 ml ekleyin.
   8. Inkübatör hücreleri dönün.

3. NIH 3T3 hücreleri ve Enfeksiyon

1. NIH kurulması3T3 Kültürleri ve Tohumculuk
   1. Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde, NIH 3T3 hücrelerini eritin ve 15 ml'lik bir tüpe transfer. Yavaş yavaş NIH 3T3 ortamında (DMEM +% 10 FBS) 9 ml ekleyin.
   2. 180 x tüp santrifüj g 5 dakika ve süpernatan atılır.
   3. 10 cm'lik bir kültür tabağına, NIH 3T3, orta ve devir, 10 ml ile tekrar süspansiyon hücreleri.
   4. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatörü içinde inkübe hücreleri. Bu kendiliğinden dönüşüm (ve odak oluşumu bu nedenle, bazal seviye) sıklığı gibi bir kültür konfluent ulaştıktan sonra artar, NIH 3T3 hücreleri, her zaman underconfluent (% 50-60) tutulması çok önemlidir.
   5. 10 cm çanak başına tohum 3 x 10 ⁵ hücreleri ve ertesi gün enfeksiyonu için O / N kuluçkaya yatmaktadır.
2. Enfeksiyon
   1. 0.45 um gözenek boyutlu naylon zar filtre boyunca, 10 ml'lik atılabilir bir şırınga kullanılarak, ve 15 ml aktararak Plat-E, çanak retroviral süpernatan hasattüp.
   2. (Antibiyotikler olmadan) hücrelere taze Plat-E orta 10 ml ekleyin ve inkübatör onları geri.
   3. Enfekte NIH 3T3 hücre çanak orta aspire ve virüs ihtiva eden, süzüldü süpernatanın 5 normal NIH 3T3 ortamının ml ve 5 mi ekleyin.
   4. 6 ug / ml'lik bir konsantrasyonda çanak polybrene ekleyin.
   5. 37 ° C'de,% 5 _CO2 hücreleri O / N inkübe edin.
   6. Enfeksiyon ikinci tur için 3.2.5 - Ertesi gün, tekrar 3.2.1 adımları.
   7. Normal NIH 3T3 ortamı ile virüs içeren ortam değiştirin.
   8. Gerektiğinde ortamının değiştirilmesiyle, NIH 3T3 hücreleri, 2-3 hafta boyunca büyümeye izin verin. Çoğaltma plakalarından bütün hücre lizatları üzerindeki geleneksel protein elektroforezi ve immüno-lekeleme ile, ilgilenilen proteinin ekspresyonunu kontrol edin.

4. Boyama ve miktarının belirlenmesi

1. Kristal Violet Boyama
   1. NIH 3T3 orta aspire ve yemekler yerBuz üzerinde.
   2. Buz soğukluğunda PBS ile iki kez yemekler yıkayın.
   3. 10 dakika boyunca buz soğukluğunda metanol ile hücreleri saptamak.
   4. Buz yemekler çıkarın metanol havalandırın, ve 25% metanol (RT) 'de yapılan% 0.5 kristal mor çözelti 3 ml ekleyin.
   5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yemekler inkübe edin.
   6. Kristal viyole çözüm aspire ve hiçbir renk durulama kapalı gelene kadar dikkatli Milli-Q H ₂ O ile çanak durulayın.
   7. Yemekleri masa üstü Ç / N kurumasını bekleyin (ortaya).
2. Foci Kantifikasyon
   1. Yemekler, kuru, plaka üzerinde hücrelerin koyu renkli koleksiyonlarını ölçmek için bir cetvel kullanın. Sadece olarak çapı 5 mm'nin olanlar saymak "odaklar." Odaklarının sayısını kaydedin ve ortalamalar ve kontrollere göre önemini hesaplamak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

MXD3 MYC / MAX / MAD ağının bir üyesi olan temel bir sarmal döngü-heliks lösin fermuar (bHLHZ) transkripsiyon faktörüdür. Bu MAD ailesinin ^13-15 bir atipik üyesi olduğunu ve karsinogenezinde ^16,17 rol bildirilmiştir. PBABEpuro (negatif kontrol) ve myc (pozitif kontrol) ile karşılaştırıldığında, MXD3 aşın NIH 3T3 yemekler önemli ölçüde daha az odakları (Şekil 1A) vardı. Şekil 1 B 'de veri önemini belirlemek için birden çok deney...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

FFA in vitro malign transformasyon değerlendirmek için hızlı ve kolay bir yöntem sağlar. Aday genler nispeten büyük sayıda taranması için uygundur ve mütevazı teknik gereksinimler, maliyet açısından tercih. Bundan başka, iki ya da daha çok gen birlikte eksprese edilebilir kombinasyonunun tümörijenik potansiyelini değerlendirmek için (bazen "işbirliği" deneyi olarak da adlandırılır). Bu testin avantajları basit tekniği, miktar kolaylığı ve nispeten kısa dönüş etrafı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
pBABE-puro vector	Addgene	Plasmid 1764	cloning vector
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	RV-101	cell line for viral production
NIH 3T3 Cell Line murine	Sigma-Aldrich	93061524	cell line for focus formation assay
10 ml BD Luer-Lok tip syringe	BD Biosciences	309604	viral production reagent
0.45 μm Puradisc Syringe Filter	Whatman	6750-2504	viral production reagent
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences, Inc.	23966-2	cell transfection reagent
Polybrene Infection / Transfection Reagent	EMD Millipore	TR-1003-G	cell transfection reagent
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	cell stain reagent
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	plasmid purification
BD Falcon Tissue Culture Dishes	BD Biosciences	353003	cell culture supplies
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	cell culture media
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	cell culture supplies
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985-062	cell culture media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044	cell culture media