Concentre Formação: Um Ensaio Celular para Determinar o Potencial oncogénica de um Gene

Resumo

O ensaio de formao de foco fornece um método simples para avaliar o potencial de transformação de um oncogene candidato.

Resumo

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals¹. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)². When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci¹ that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

Introdução

As células tumorais podem ser distinguidos dos seus homólogos normais por uma ampla gama de alterações, a partir de padrões de expressão de genes para epigenomics a alterações morfológicas e proliferativas. Entre estes últimos, redução da dependência do soro, a perda de contacto (densidade) de inibição, a aquisição de proliferação independente de ancoragem e, em última análise, a capacidade de formar tumores quando injectadas em animais são indicadores úteis, mensuráveis ​​de transformação maligna ^3. Vários in vitro e em ensaios in vivo têm sido desenvolvidos para a transformação celular. Os ensaios in vitro por objectivo a identificação e medindo alterações na morfologia da cultura (ensaio de formação de foco), dinâmica de cultura (taxa de crescimento, a densidade de saturação) e o factor de crescimento (crescimento em soro reduzido) ou ancoradouro (crescimento em agar mole) requisitos. O padrão de ouro para a determinação do carácter maligno de um tipo de célula permanece a formação de tumores (xenoenxertos) em animais experimentais. No entanto, tele custa e comprimento de estudos in vivo nem sempre fazê-los justificável como uma primeira etapa de validação ou screening de oncogenes candidatos. Embora nenhum ensaio in vitro fornece uma avaliação definitiva do potencial oncogénico de um gene, que não fornecem informações sobre potencial oncogénico que pode afinar futuro em estudos in vivo. Um dos sistemas mais utilizados para a avaliação do potencial oncogênico in vitro é o foco Formação Ensaio ^2. Esta abordagem baseia-se na utilização de NIH 3T3 de fibroblastos de rato, uma linha de células não transformadas que mostram forte inibição de contacto. A sobre-expressão de um oncogene resulta em perda do crescimento dependente de densidade; As células transformadas podem então crescer em múltiplas camadas, formando "focos", facilmente visualizado contra a monocamada de células não transformadas fundo. O Ensaio de formação de focos, em seguida, mede a capacidade de um oncogene candidato para induzir a transformação maligna, como evidenciado pela perda de contacto Inibiç como um fenótipo mensurável. O FFA tem sido utilizado para avaliar a sobre-expressão por transformação de proteína-quinases (por exemplo, Src ^{4, 5} BRAF), factores de transcrição (por exemplo, N-myc ⁶⁾ receptores, L-acoplados à proteína (por exemplo, P2RY8 ⁷⁾ e GTPases (p.ex. , Ras ^1), entre outros. A relativa facilidade deste ensaio faz-se uma boa escolha que vai proporcionar uma resposta rápida e visualmente claro para se sobre-expressão do gene é suficiente para transformar células de fibroblastos NIH 3T3 de rato in vitro.

O FFA descrito neste protocolo utiliza a linha celular de empacotamento Plat-E ^8, o qual fornece as proteínas virais de empacotamento, e o vector retroviral pBABEpuro ⁹ (Addgene plasmídeo 1764) para a produção de retrovírus. Após transfecção com a construção pBABEpuro contendo o gene de interesse, a linha celular Plat-E vai produzir retrovírus ecotrópico que pode ser utilizado para infectar as células NIH 3T3. Tseu método de entrega gene viral é mais eficiente do que os métodos de transfecção química tradicionais e oferece uma maneira de expressar de forma sustentável o gene ^10. Uma vez incorporado no genoma das células NIH 3T3, a sobre-expressão do gene de interesse é impulsionado pelo repetições terminais longas virais (LTR) ^11. Esta expressão constante pode ser usado para determinar se o gene de interesse tem actividade oncogénica, tal como medido pela formação de focos, sobre as células NIH 3T3.

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Protocolo

1. Fazer os vetores virais

As sequências de codificação para o gene de interesse, bem como os controlos positivos e negativos, são inseridos em pBABEpuro por métodos tradicionais de clonagem (amplificação por PCR, digestão de restrição e de ligação). Existem quatro locais de restrição no vector em que o DNA pode ser inserido: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sall.

1. Prepare plasmídeo DNA transfecção-grade a partir de células competentes, segundo o kit plasmídeo midi QIAGEN.
2. Medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro NanoDrop2000.

2. Retrovirus Produção

A linha celular de empacotamento Plat-E vai ser utilizado para produzir retrovírus ecotrópico que permitirá obter o ADNc de interesse a células NIH 3T3.

1. Estabelecer Plat-E culturas de células congeladas
   1. Rapidamente descongelar células Plat-E de um ° C banho de água 37 e transferir para um tubo de 15 ml. Lentamente, adicionar 9 ml de meio de Plat-E (DuMeio Eagle Modificado de lbecco (DMEM) + 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) + penicilina e estreptomicina).
   2. Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
   3. Re-suspender as células com 10 ml de Plat-E e meio de transferência para uma placa de cultura de 10 centímetros.
   4. Incubar as células em uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2 até que eles são de 80-90% confluentes (cerca de 2 dias).
2. Splitting celular
   1. Aspirar o meio e lave as células uma vez com PBS.
   2. Adicionar 2 ml de 0,05% de tripsina-EDTA e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente.
   3. Retire as células por finger tapping, adicione 10 ml de meio Plat-E, e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml.
   4. Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
   5. Ressuspender as células com 10 ml de meio Plat-E e semear-los em novas placas a 1: 4-1: 6 diluições.
3. Plat-E Sementeira e Transfection
   1. Semente de 2 x 10 ⁶células por 10 cm prato de cultura, utilizando meio de Plat-E sem quaisquer antibióticos.
   2. Incubar as células S / N em uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2.
   3. No dia seguinte, transferir 300 ul de Opti-MEM em 1,5 ml de tubo de microcentrífuga.
   4. Adicionar 27 ul de polietilenimina (PEI), um reagente de transfecção de baixo custo ^12, o tubo preparado com Opti-MEM. Misturar suavemente batendo por dedo e incubar durante 5 min à TA.
   5. Adicionar 9 ug de ADN plasmídeo de transfecção de grau para o tubo de Opti-MEM / PEI, misturar suavemente em vórtex e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
   6. Adicionar o ADN / PEI gota a gota complexo no prato Plat-E, e incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO _2.
   7. No dia seguinte, aspirar o meio contendo o reagente de transfecção e adicione 10 ml de meio Plat-E fresco (sem antibióticos).
   8. Retorne as células para a incubadora.

3. As células NIH 3T3 e Infecção

1. Estabelecer NIHCultures 3T3 e propagação
   1. Rapidamente descongelar células NIH 3T3 numa ° C num banho de água a 37 e transferir para um tubo de 15 ml. Adiciona-se lentamente 9 ml de meio de NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS).
   2. Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
   3. Ressuspender as células com 10 ml de NIH 3T3 médio e transferir para um 10 centímetros prato de cultura.
   4. Incubar as células em uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2. É muito importante que as células NIH 3T3 são sempre mantidas underconfluent (50-60%), tal como a frequência de transformação espontânea (e, por conseguinte, níveis basais de formação de focos) aumenta uma vez que uma cultura atinge a confluência.
   5. Semente de 3 x 10 ⁵ células por placa de 10 cm e incubar O / N para a infecção, no dia seguinte.
2. Infecção
   1. Colher o sobrenadante retroviral do prato Plat-E usando uma seringa descartável de 10 ml, filtração através de um filtro de membrana de nylon de 0,45 um de tamanho de poro, e transferindo-o para um 15 mltubo.
   2. Adicionar 10 ml de meio Plat-E fresco às células (sem antibióticos), e devolvê-las para a incubadora.
   3. Aspirar o meio do prato de células NIH 3T3 de estarem infectados, e adicione 5 ml de meio de NIH 3T3 regular e 5 ml de sobrenadante filtrado que contém o vírus.
   4. Adicionar ao prato polibreno a uma concentração de 6 ug / ml.
   5. Incubar as células S / N a 37 ° C, 5% de CO _2.
   6. No dia seguinte, repita os passos 3.2.1 - 3.2.5 para uma segunda rodada de infecção.
   7. Substituir o meio contendo vírus NIH 3T3 com meio regular.
   8. Permitir que as células NIH-3T3 para crescer durante 2-3 semanas, substituindo o meio, conforme necessário. Verifique a expressão da proteína de interesse por electroforese e imunotransferência de proteína convencional em lisados ​​de células inteiras a partir de placas réplica.

4. Coloração e Quantificação

1. Violeta Cristal Coloração
   1. Aspirar o meio de NIH 3T3 e colocar os pratosem gelo.
   2. Lavam-se as placas duas vezes com PBS gelado.
   3. Fixar as células com metanol gelado durante 10 min.
   4. Remover os pratos de gelo, aspirar o metanol, e adicionar 3 ml de solução de violeta cristal 0,5% feitos em 25% de metanol (RT).
   5. Incubar as placas durante 5 min à TA.
   6. Aspirar a solução de cristal violeta e lavar cuidadosamente o prato com Milli-Q _H2O até sem cor sai na lavagem.
   7. Permitir que os pratos para secar O / N em uma bancada (descoberto).
2. Focos Quantificação
   1. Uma vez que os pratos estão secos, use uma régua para medir as coleções de cor escura de células na placa. Contar apenas aqueles que são maiores do que 5 mm de diâmetro, como "focos". Anote o número de focos e calcular médias e a importância em comparação com os controles.

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Resultados

MXD3 é um fator fundamental zipper hélice-alça-hélice leucina (bHLHZ) de transcrição que é um membro da MYC / MAX / network MAD. Ele é um membro da família atípica MAD ^13-15, e tem sido referida como estando envolvida na carcinogénese ^16,17. Quando comparado com pBABEpuro (controlo negativo) e MYC (controlo positivo), os pratos de NIH 3T3 que sobre-expressas foi MXD3 tinham significativamente menos focos (Figura 1A). Os dados na Figura 1B foram recolhido...

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Discussão

A FFA fornece um método rápido e fácil de avaliar a transformação maligna in vitro. É passível de exibição de um número relativamente grande de genes candidatos e seus requisitos técnicos modestos torná-lo rentável. Além disso, dois ou mais genes pode ser co-expressa (por vezes referido como um ensaio de "cooperação") para avaliar o potencial tumorigénico de combinação. As vantagens deste ensaio contar com a sua técnica simples, a sua facilidade de quantificação e a sua relativam...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
pBABE-puro vector	Addgene	Plasmid 1764	cloning vector
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	RV-101	cell line for viral production
NIH 3T3 Cell Line murine	Sigma-Aldrich	93061524	cell line for focus formation assay
10 ml BD Luer-Lok tip syringe	BD Biosciences	309604	viral production reagent
0.45 μm Puradisc Syringe Filter	Whatman	6750-2504	viral production reagent
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences, Inc.	23966-2	cell transfection reagent
Polybrene Infection / Transfection Reagent	EMD Millipore	TR-1003-G	cell transfection reagent
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	cell stain reagent
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	plasmid purification
BD Falcon Tissue Culture Dishes	BD Biosciences	353003	cell culture supplies
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	cell culture media
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	cell culture supplies
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985-062	cell culture media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044	cell culture media