Фокус Образование: клеточном анализе для определения онкогенных потенциал гена

Резюме

Фокус Формирование анализ обеспечивает простой метод для оценки преобразующую потенциал кандидата онкоген.

Аннотация

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals¹. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)². When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci¹ that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

Введение

Опухолевые клетки можно отличить от их нормальных аналогов широким диапазоном изменений, из форм генной экспрессии в Epigenomics в морфологических и пролиферативных изменений. Среди последних, уменьшение зависимости от сыворотки, потеря контакта (плотности) торможения, приобретение крепления независимой пролиферации и, в конечном счете, способность образовывать опухоли при введении животным полезны, измеримые показатели злокачественной трансформации ^3. Несколько в пробирке и в естественных условиях анализов были разработаны для трансформации клеток. В пробирке анализы направлены на выявление и измерение изменений в области культуры морфологии (образование анализа фокус), динамики культуры (темп роста, плотность насыщения) и фактор роста (рост в восстановленной сыворотки) или якорь (рост на мягком агаре) требованиям. Золотой стандарт для определения злокачественной природы клеток определенного типа, остается формирование опухоли (ксенотрансплантаты) у экспериментальных животных. Тем не менее, тон стоит и продолжительность обучения в естественных условиях не всегда делают их оправдано в качестве первого этапа проверки или досмотра кандидатов онкогенов. Хотя ни анализ в пробирке не дает определенную оценку онкогенного потенциала гена, они дают полное представление онкогенного потенциала, который может сузить будущее в естественных условиях исследования. Одним из наиболее широко используемых систем для оценки онкогенного потенциала в пробирке находится в центре внимания Формирование Анализ ^2. Этот подход основан на использовании NIH-3T3 мыши фибробластов, не-трансформированной клеточной линии, которая показывает сильное ингибирование контактной. Избыточная экспрессия онкогенов приводит к потере плотности в зависимости от роста; Трансформированные клетки можно затем растут в несколько слоев, образующих "очаги", легко визуализировать на фоне монослоя нетрансформированных клеток. Фокус Формирование Анализ, то, измеряет способность кандидата онкоген, чтобы вызвать злокачественную трансформацию, о чем свидетельствует потеря контакта Inhibition как измеримое фенотипа. FFA был использован для оценки трансформации сверхэкспрессией протеинкиназ (например, Src ^{4, 5} BRAF), факторы транскрипции (например, N-Myc ^6), G-белками рецепторы (например, P2RY8 ⁷⁾ и GTPases (например, Рас ^1), среди прочих. Относительная простота этого теста делает его хорошим выбором, который обеспечит быстрый и визуально четкий ответ на ли избыточная экспрессия гена достаточно, чтобы превратить NIH 3T3 фибробластов мышей клетки в пробирке.

FFA описано в данном протоколе используется Plat-E упаковка клеточную линию ^8, который обеспечивает вирусные белки упаковки и ретровирусный вектор pBABEpuro ⁹ (Addgene плазмиду 1764), чтобы произвести ретровирус. После трансфекции с pBABEpuro конструкции, содержащей нужный ген, клеточная линия Plat-E будет производить экотропного ретровируса, который может быть использован для инфицирования клеток NIH-3T3. Tвирусная способ доставки генов является более эффективным, чем традиционные методы химической трансфекции и предлагает способ устойчиво экспрессировать ген ^10. После того, как включается в геном клеток NIH-3T3, избыточная экспрессия интересующего гена приводится в действие вирусных длинные концевые повторы (LTR), промотор ^11. Эта константа выражение может быть использовано для определения того, имеет ли интерес ген онкогенного активности, измеренной с образованием очагов на клетках NIH-3T3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Создание вирусных векторов

Кодирующие последовательности для интересующего гена, а также положительных и отрицательных контролей, которые вставлены в pBABEpuro традиционными методами клонирования (ПЦР-амплификации, ограничение и лигирования). Существуют четыре сайты рестрикции на векторе, где ДНК могут быть вставлены: BamHI, SnaBI, EcoRI и SalI.

1. Подготовка трансфекции-класса плазмидной ДНК из компетентных клеток с использованием плазмиды миди набор QIAGEN.
2. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop2000.

2. ретровируса Производство

Plat-E упаковка клеточная линия будет использоваться для получения экотропного ретровируса, который будет доставлять кДНК интерес для клеток NIH-3T3.

1. Создание Плат-E культур из замороженных клеток
   1. Быстро оттаивают Plat-E клеток в ° С на водяной бане при 37 и передавать в 15 мл коническую трубку. Медленно добавьте 9 мл Плат-E среды (Дуlbecco в модификации Дульбекко (DMEM) + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) + пенициллина и стрептомицина).
   2. Центрифуга трубки на 180 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
   3. Повторное приостановить клетки с 10 мл Plat-E среды и передачи в 10 см чашки для культивирования.
   4. Инкубируйте клетки в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе, пока они не 80-90% сливной (около 2 дней).
2. Сотовый Разделение
   1. Аспирируйте среды и мыть клетки один раз PBS.
   2. Добавить 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
   3. Открепления клеток от палец нажатие, добавить 10 мл Plat-E среды, и передачи клеточной суспензии в 15 мл пробирку.
   4. Центрифуга трубки на 180 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
   5. Ресуспендируют клеток с 10 мл Plat-E среды и семян их в новые чашки 1: 4-1: 6 разведений.
3. Плат-E Посевная и Трансфекцию
   1. Семена 2 × 10 ⁶клеток на 10 см блюдо культуры с использованием Плат-E среду без каких-либо антибиотиков.
   2. Инкубируйте клетки O / N в 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора.
   3. На следующий день, передача 300 мкл Opti-MEM в 1,5 мл пробирке.
   4. Добавить 27 мкл полиэтиленимина (PEI), экономически эффективный реагента для трансфекции ^12, на подготовленную трубу с Opti-MEM. Осторожно перемешать пальцем разговоров и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
   5. Добавить 9 мкг трансфекции класса плазмидной ДНК в OPTI-MEM / PEI трубки, осторожно перемешать на вортексе и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
   6. Добавить ДНК / ПЭИ комплекс по каплям в Plat-E блюдо и инкубировать O / N при 37 ° С, 5% СО _2.
   7. На следующий день, аспирации среду, содержащую реагента для трансфекции и добавить 10 мл свежей Плат-E среды (без антибиотиков).
   8. Вернуться клеток в инкубатор.

3. NIH 3T3, и инфекции

1. Создание NIH3T3 Культуры и посев
   1. Быстро оттаивают NIH-3T3 клеток в ° С на водяной бане при 37 и передавать в 15 мл пробирку. Медленно добавляют 9 мл NIH-3T3 среде (DMEM + 10% FBS).
   2. Центрифуга трубки на 180 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
   3. Ресуспендируют клеток с 10 мл NIH 3T3 среды и перенести в 10 см блюдо культуры.
   4. Инкубируйте клетки в 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора. Очень важно, что NIH 3T3, всегда хранятся underconfluent (50-60%), так как частота спонтанного преобразования (и, следовательно, базальных уровней фокусов формирования) увеличивает когда культура достигает слитности.
   5. Семя 3 х 10 ⁵ клеток на 10 см чашку и инкубировать O / N для инфекции следующий день.
2. Инфекция
   1. Урожай ретровирусный супернатант от Plat-E тарелки с помощью 10 мл одноразовый шприц, фильтрации его через нейлон размер мембранный фильтр 0,45 мкм пор, и передачи его в 15 млтруба.
   2. Добавить 10 мл свежего Плат-E среды к клеткам (без антибиотиков), и вернуть их в инкубатор.
   3. Аспирируйте среду от клеток NIH-3T3 блюдо быть заражены, и добавляют 5 мл регулярной NIH-3T3 среды и 5 мл, содержащих вирус отфильтрованной надосадочной жидкости.
   4. Добавить полибрена к чашке с концентрацией 6 мкг / мл.
   5. Инкубируйте клетки O / N при 37 ° С, 5% СО _2.
   6. На следующий день повторите шаги 3.2.1 - 3.2.5 для второго раунда инфекции.
   7. Заменить Содержащую вирус среду с регулярным NIH-3T3 среды.
   8. Разрешить клетки NIH-3T3 культивировали в течение 2-3 недель, заменяя среду по мере необходимости. Проверка экспрессии интересующего белка с помощью обычного электрофореза белков и иммуноблоттинга на целых клеточных лизатов из реплик пластин.

4. Окрашивание и количественного

1. Кристалл Фиолетовый Окрашивание
   1. Аспирируйте среду NIH 3T3 и поместите посудуна льду.
   2. Мыть посуду в два раза с ледяной PBS.
   3. Зафиксировать клетки с ледяной метанола в течение 10 мин.
   4. Удалить посуду из льда, аспирации метанола и добавляют 3 мл 0,5% -ного раствора кристаллического фиолетового, сделанные в 25% метаноле (RT).
   5. Инкубируйте блюда в течение 5 мин при комнатной температуре.
   6. Аспирируйте кристаллическим фиолетовым решение и тщательно промыть блюдо с Milli-Q H ₂ O, пока цвет не сходит при полоскании.
   7. Разрешить блюда высохнуть O / N на настольной (непокрытый).
2. Очаги Количественное
   1. После того, как блюда в сухом, используйте линейку, чтобы измерить потемневшие коллекции клеток на пластине. Только рассчитывать те, которые больше, чем 5 мм в диаметре, как "очагов." Записать число очагов и рассчитать средние и значение по сравнению с контрольной группой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

MXD3 является основной спираль-петля-спираль лейцин молния (bHLHZ) транскрипционный фактор, который является членом MYC / MAX / MAD сети. Это нетипичный член MAD семьи ^13-15 и было сообщено, участвуют в канцерогенезе ^16,17. По сравнению с pBABEpuro (отрицательный контроль) и MYC (положительный конт?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

FFA обеспечивает быстрый и простой способ оценить злокачественной трансформации в пробирке. Это поддается скрининга относительно большого количества генов-кандидатов, и его скромные технические требования делают рентабельным. Кроме того, два или более генов может быть совместно?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
pBABE-puro vector	Addgene	Plasmid 1764	cloning vector
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	RV-101	cell line for viral production
NIH 3T3 Cell Line murine	Sigma-Aldrich	93061524	cell line for focus formation assay
10 ml BD Luer-Lok tip syringe	BD Biosciences	309604	viral production reagent
0.45 μm Puradisc Syringe Filter	Whatman	6750-2504	viral production reagent
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences, Inc.	23966-2	cell transfection reagent
Polybrene Infection / Transfection Reagent	EMD Millipore	TR-1003-G	cell transfection reagent
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	cell stain reagent
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	plasmid purification
BD Falcon Tissue Culture Dishes	BD Biosciences	353003	cell culture supplies
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	cell culture media
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	cell culture supplies
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985-062	cell culture media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044	cell culture media