عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em&gt; السالمونيلا الملهبة لل</em&gt; جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

Summary

وتم إعداد مقايسة الإنتاجية العالية لفي المختبر النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو، وتكرارها في الخلايا البلعمية مع القدرة الإنتاجية العالية. وقد استخدمت طريقة لتقييم السالمونيلا خروج المغلوب الجينات سلالات متحولة للتدخلات في التفاعلات المضيف الممرض.

Abstract

أنواع السالمونيلا ومسببات الأمراض الحيوانية المنشأ والأسباب الرئيسية للأمراض التي تنقلها الأغذية في البشر والماشية ^1. فهم الآليات الكامنة وراء التفاعلات السالمونيلا -host تعتبر مهمة لتوضيح المرضية الجزيئي للعدوى السالمونيلا. حماية فحص جنتاميسين إلى النمط الظاهري جمعية السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الخلايا البلعمية تم تكييفها للسماح الفرز الفائق الإنتاجية لتحديد أدوار المسوخ حذف السالمونيلا التيفية الفأرية الملهبة للالمصلي في التفاعلات المضيف باستخدام RAW 264.7 الضامة الفئران. بموجب هذا البروتوكول، التباين في القياسات وانخفاض كبير مقارنة مع بروتوكول قياسي، لأنه من النوع البري وسلالات متحولة متعددة يمكن اختبارها في صحن الثقافة ونفس في نفس الوقت. استخدام ماصات متعددة يزيد من الإنتاجية ويحسن الدقة. وعلاوة على ذلك، المخاوف المتعلقة باستخدام أقل حوتمت معالجة خلايا الحادي لكل بئر في صحن الثقافة 96 أيضا. هنا، كان يعمل بروتوكول لتعديل في المختبر باستخدام فحص السالمونيلا غزو الخلايا البلعمية بنجاح إلى النمط الظاهري 38 الفردية المسوخ السالمونيلا الحذف للجمعية، والغزو والتكرار داخل الخلايا. يتم عرض الظواهر في المختبر، وقد أكد بعض منها في وقت لاحق أن يكون في الظواهر الحية في نموذج حيواني. وهكذا، فإن تعديل، فحص موحد لجمعية النمط الظاهري السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الضامة يمكن استخدامها مع القدرة الإنتاجية العالية على نطاق أوسع لدراسة التفاعلات البكتيرية المضيفة.

Introduction

Nontyphoidal السالمونيلا هي الأسباب الهامة للأمراض المعوية في جميع الفقاريات. السالمونيلا في البشر هو من بين أكبر الأمراض التي تنقلها الأغذية البكتيرية ^1. ويتحقق توصيف الآليات الجزيئية التي تدعم تفاعلات السالمونيلا مع المضيفين الحيوان بشكل رئيسي من خلال دراسة السالمونيلا التيفية الفأرية الملهبة للالمصلي (STM) في نماذج زراعة الأنسجة الحيوانية والعدوى. سوف اكتساب رؤى في التفاعلات STM-المضيف تساعدنا على فهم كيفية السالمونيلا البقاء والنمو داخل الخلايا المضيفة. التحدي الأول في دراسة هذه التفاعلات هو تحديد العديد من العوامل المشاركة ممكن من كل من المضيف والممرض، ولكن يتم عرقلة هذه المساعي إلى حد كبير من قبل صعوبات كبيرة في التعامل مع اثنين من النظم البيولوجية المعقدة المستقلة في وقت واحد، أي المضيف والسالمونيلا، تحت الظروف الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، repert كبيرoire من السالمونيلا والجينات المضيف المحتمل ترميز العوامل التي تدخل في التفاعلات البيولوجية المضيفة تتطلب منصة عالية الإنتاجية لمواجهة هذا التحدي.

وتعديل، فحص موحد لجمعية النمط الظاهري السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الضامة مع القدرة الإنتاجية العالية وضعت لدراسة مجموعة كبيرة من الجينات المرجح الانخراط في التفاعلات السالمونيلا -host. وقد وضعت حماية فحص جنتاميسين في عام 1973 ^2، ولكن لأول مرة وصف دقيق من قبل Elsinghorst في عام 1994 ^3،4. أصبح الآن هو أداة موحدة لدراسة العديد من مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا خارج الجسم، بما في ذلك السالمونيلا ^5،6. تجنب البكتيريا المنضوية التعرض للقتل من قبل بعض المضادات الحيوية، مثل جنتاميسين، التي لا يمكن ان تخترق الخلايا حقيقية النواة ^3. من خلال الاستفادة من هذه الظاهرة، وحماية جنتاميسين فحص يقيس بقاء ونمو الخلايا باcterial مسببات الأمراض. ثلاثة أحداث أثناء العدوى، أي ارتباط مع الخلايا حقيقية النواة، والغزو والتكرار، يمكن تقييم لمسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا استنادا إلى الفاصل الزمني بين الإصابة والعلاج جنتاميسين، ومزيد من الحضانة (الشكل 1). خطوط الخلايا حقيقية النواة توفر بيئة الفسيولوجية التي هي أقل تعقيدا من النماذج الحيوانية ذات الصلة للدراسات التفاعل المضيف الممرض.

حماية فحص جنتاميسين هو منصة مناسبة لدراسة التفاعلات STM-المضيف، ولكن الفحص القياسية في صحن الثقافة 24 جيدا لديه قدرة منخفضة الإنتاجية. وحدد التحليل الحسابي في الجسم الحي من مجموعات البيانات 149 منتجات السالمونيلا الجين الذي من المتوقع أن تتفاعل مع ما يقرب من 300 منتج الجين المضيف (بيانات غير منشورة). ليس لديها معيار جنتاميسين الحماية فحص القدرة على النمط الظاهري هذا العدد من المسوخ بكفاءة.

في additأيون، وحماية فحص جنتاميسين يمكن كشف نظريا غزو حتى بكتيريا واحد. بسبب هذه الحساسية المتأصلة، البيانات الخام عرضة للالفروق الفنية عندما كرر في أوقات مختلفة. الضوابط الداخلية وعرض البيانات النسبي بعد تطبيع ضرورية لتفسير مغزى النتائج. ونظرا لهذه الاعتبارات، تم وضع تعديل، موحد جنتاميسين الحماية فحص لتعزيز قدرة الاختبار وزيادة الدقة.

بروتوكول التالية هي مفصلة وموضحة لإجراء تعديل مقايسة حماية الجنتاميسين باستخدام أطباق ثقافة 96 جيدا والبلاعم RAW264.7 خط الخلية الفئران. مقارنة بروتوكول قياسي في أطباق ثقافة 24 جيدا، وبروتوكول تعديل والمزايا التالية: 1) عن طريق أطباق ثقافة 96 جيد يسمح ما يصل الى 10 سلالات متحولة مختلفة ليتم phenotyped بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية الداخلية مع قوة إحصائية كافية.2) يتم تخفيض التباين في النتائج بشكل كبير، لأنه يتم اختبار سلالات متحولة في صحن الثقافة نفسها وفي نفس الوقت؛ 3) استخدام ماصات متعددة القنوات يزيد الإنتاجية مع تقليل عامل التعب. وأخيرا، مقارنة مع 24 أطباق ثقافة جيدا، والتعامل مع مخاوف من خلايا أقل المضيفة لكل بئر في صحن الثقافة 96 جيدا من خلال تحسين وتوحيد بروتوكول.

وباختصار، فإن تعديل، فحص موحد لفي المختبر النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو وتكرارها في الخلايا البلعمية يزيد الدقة ويحقق القدرة الإنتاجية العالية مع خفض عامل التعب.

Protocol

1. الفئران بلعم RAW264.7 خلية ثقافة

1. النمو المنخفض مرور عدد خلايا البلاعم الفئران، RAW264.7 ^(و® عدد ATCC، TIB-71) في T-75 خلية قارورة الثقافة تنفيس غطاء المرشح في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 0.5٪ NaHCO _3، و 1٪ 100X الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) عند 37 درجة مئوية، في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
2. خلايا مرة واحدة تصل إلى نقطة التقاء 60-80٪ في قارورة، واستخدام مكشطة خلية لحصاد الخلايا، وعدد الخلايا في عدادة الكريات وحساب تركيز الخلية.
3. resuspend الخلايا ويخفف من تركيز الخلية إلى 2.5 × 10 ⁵ / مل الطازجة DMEM في خلية ثقافة المتوسط. استخدام ماصات متعددة لوحة 200 ميكرولتر من DMEM خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على 5 × 10 ⁴ الخلايا في كل بئر من 96 لوحات جيدا ثقافة الخلية.
4. لوحة أربعة آبار من كل سلالة السالمونيلا. تشكيل ثلاث لوحات منفصلة لمجموعة واحدةمن أكلة خلايا الغزو الفحص، ووضع علامة عليها مع "جمعية"، "الغزو" و "تكرار"، على التوالي.
5. وضع لوحات في 5٪ CO ₂ الحاضنة عند 37 درجة مئوية على السماح للخلايا البلاعم لنعلق على الجزء السفلي من الآبار.

2. إعداد السالمونيلا من نوع البرية والمسوخ

1. في نفس اليوم من إعداد خلايا البلاعم RAW264.7، واختيار واحدة من المستعمرات البرية من نوع (WT) الملهبة السالمونيلا التيفية الفأرية المصلي 14028s، DinvA متحولة، DphoP متحولة، واختبار سلالات متحولة المطلوب، والثقافة لها في لوريا، Bertani ( LB) مرق تستكمل مع المضادات الحيوية حسب الاقتضاء. استخدام كل مجموعة من الخلايا البلعمية المقايسات الغزو لاختبار ما يصل إلى 10 سلالات متحولة (DinvA متحولة وDphoP متحولة لا عيب في غزو الخلايا وتكرارها، على التوالي).
2. تنمو البكتيريا لمدة 14 ساعة عند 37 درجة مئوية مع لياليhaking في 220 دورة في الدقيقة في كل 5 مل من مرق LB في توج فضفاضة 14 مل البولي بروبلين في أنبوب أسفل مستديرة. LB مرق يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة، في حالتنا، فإن معظم سلالات متحولة مقاومة لكاناميسين، 50 ميكروغرام / مل
3. في اليوم التالي، ثقافة فرعية لكل من على ثقافات سلالات السالمونيلا في سهل 5 مل من مرق LB في نسبة 01:50 ل4 ساعة إضافية مع اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
4. قراءة OD ₆₀₀ قيم كل ثقافة البكتيرية على طيفي، وكل قراءة أن يتراوح 0،6-1،2 لتحسين السالمونيلا جزيرة المرضية-1 النوع الثالث إفراز نظام (SPI-1 TTSS) التعبير الجيني للغزو.
5. استخدام الصيغة من 1 OD ₆₀₀ = 7.5 × 10 ⁸ خلية / مل لتقدير تركيز البكتيريا، ثم تمييع البكتيريا إلى تركيز 5 × 10 ⁶ خلية / مل في DMEM الطازجة خلية ثقافة المتوسط.

3. الغزو الفحص في 96 لوحة جيدا الثقافة

1. إزالة ثلاثة سل 96 جيدلوحات ثقافة لتر من الحاضنة CO ₂ ويغسل مرة واحدة كل جيدا مع 200 ميكرولتر من العازلة 1X PBS.
2. بعد غسل وإزالة كاملة من برنامج تلفزيوني، إضافة 200 ميكرولتر البكتيريا في DMEM المتوسطة (انظر أعلاه) في كل بئر. هذه النتائج في 1 × 10 ⁶ خلايا السالمونيلا في كل جيدا وتعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 20: 1.
3. أجهزة الطرد المركزي لوحات في 1،000 x ج في الناقل مغلق لمدة 10 دقيقة، ثم استبدال لوحات (الساعة صفر) في 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ الحاضنة لمدة 30 دقيقة. لكل سلالة، وإنشاء ما لا يقل عن أربعة آبار مكررة.
4. بعد 30 دقيقة، وإزالة لوحات من الحاضنة ويغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من 1X PBS لإزالة البكتيريا غير المصاحب.
5. بعد الغسيل، حفظ لوحة المسمى مع "جمعية" لمزيد من العلاج. إضافة 200 ميكرولتر من DMEM المتوسط ​​تحتوي على 100 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى كل بئر من لوحات تحمل علامة "الغزو" و "النسخ" من أجل رس قتل السالمونيلا خارج الخلية. العودة لوحات إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ الحاضنة لساعة إضافية.
6. حفظ بئر واحدة من كل سلالة المصاب لتسجيل عدد خلايا البلاعم، علاج بقية الآبار على لوحة "جمعية" مع 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة. فإن الحل تريتون ليز خلايا البلاعم والافراج عن السالمونيلا المرتبطة بها.
7. حصاد السالمونيلا من كل بئر ووضعها في أنابيب 1.5 مل إيبندورف. أداء ثلاث التخفيفات المسلسل 10 أضعاف مع 900μl 1X PBS على عينات تحصد من كل بئر، يتم تنفيذ دوامة بين كل التخفيف.
8. لوحة التخفيف الثالث، 10 ^-3، على أي LB (WT) أو LB اساسه (المسوخ) لوحات. تسمية لوحات مع السالمونيلا الاسم المناسب سلالة، عدد التخفيف، وأشر الوقت والتاريخ.
9. بعد vortexing لأنبوب تخفيف الثالث، الاستغناء عينة 10 ميكرولتر على سطح آغار وتكرار وعصرنا لما مجموعه 5 قطرات. تأكد من مساحة قطرات ميكرولتر 10 بالتساوي على خمس لوحات طبق بيتري ^7.
10. بعد قطرات نقع في آغار، وتحويل لوحات مرارا واحتضان ليلا 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ الحاضنة.
11. علاج الآبار حفظها لفرز الضامة مع 150 ميكرولتر 1XPBS تحتوي على 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 10 دقيقة.
12. بعد trypsinization، الضامة المكان إلى 1.5 مل أنابيب إيبندورف وتعاملهم مع 50 ميكرولتر من FBS لتحييد الحل التربسين / EDTA، وصمة عار الخلايا مع 0.4٪ التريبان الأزرق ويسجل لهم من خلال استخدام عدادة الكريات.
13. عندما انقضت حضانة ساعة واحدة، وإزالة "الغزو" وألواح "التكرار" من حاضنة CO _2، وغسل كل جانب "الخطوة 3.4".
14. حفظ وحة "الغزو" لمزيد من العلاج "الخطوة 3،6-3،12".
15. إضافة 200 ميكرولتر من DMEM المتوسط ​​تحتوي على جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل لو"تكرار" لوحة للحفاظ على إزالة السالمونيلا خارج الخلية في المتوسط. العودة لوحة إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ حاضنة ل22.5 ساعة إضافية.
16. في اليوم التالي، وإزالة "تكرار" لوحة من 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ الحاضنة، ويغسل كل جانب "الخطوة 3.4" ويعاملهم "الخطوة 3،6-3،12".
17. أخيرا، وإزالة لوحات أجار بعد الحضانة بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية ويسجل عدد من المستعمرات البكتيرية.
18. وينبغي أن يكون توزيع مستعمرة جيد بين 10 و 100 المستعمرات، كل بقعة يحتوي على ما يقرب من 2 إلى 20 المستعمرات، سيكون من الصعب أن يسجل إذا كان هناك أكثر من 20 مستعمرات في بقعة واحدة. إذا كان عدد منخفضة جدا أو مرتفعة جدا، replate العينة مع 10 أضعاف التخفيفات أعلى أو أقل حسب الحاجة.

تحليل البيانات 4.

1. حساب (وحدات تشكيل مستعمرة لكل مل) كفو من كل لوحة على أساس الطلاءحجم وعامل التخفيف.
2. التأكد من عدد السالمونيلا في البلاعم من خلال عدد خلايا البلاعم المسجلة من كل سلالة.
3. حساب سيلة هندسية من كفو في البلاعم من ثلاثة على الأقل من تجارب مستقلة لجمعية الخلايا، والغزو أو تكرار، على التوالي، وتطبيع أبعد إلى WT للقيمة النسبية.
4. تحليل البيانات للجمعية، والغزو، والتكرار من قبل الطالب ر -test على التوالي، وذلك بمقارنة كل سلالة لWT، وتحديد الدلالة الإحصائية من قبل القيمة ص.

النتائج

رؤية النتائج تمثيلية (الشكل 2) بعد يتم رسم البيانات على أساس تعديل أكلة غزو الخلايا الفحص. وتشمل البيانات خمس سلالات مختلفة، WT، ΔinvA، ΔphoP، متحولة A، B. ومتحولة Δ invA، والمعروف ليكون معيبا للغزو، وΔphoP المعروف أن تكون معيبة للنسخ المتماثل ^8، وت...

Discussion

يتم استخدام الحماية فحص جنتاميسين على نطاق واسع لدراسة الغزو وتكرار مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا داخل الخلية المضيفة، ومن خصوصا أداة البيولوجية الهامة لدراسة مسببات الأمراض مثل السالمونيلا، التي الغزو هي الخطوة شرطا مسبقا لإقامة العدوى ^1. يتم تط...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965
Fetal bovine serum	HyClone	SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap	Nest Biotechnology	708003
100x Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140
Cell scraper	BD Falcon	353086
96-well Cell culture plate	Corning Incorporated	3595
Luria-Bertani (LB) broth	MP Biomedicals	3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube	BD Falcon	352059
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamycin solution	Sigma	K0254
Gentamicin solution	Sigma	G1272
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200
Trypan blue	Sigma	T8154