De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, invasão e replicação em macrófagos

Resumo

Um ensaio de elevado débito para a Salmonella in vitro o fenótipo ou outra associação bacteriana, invasão e replicação em células fagocíticas, com capacidade de alto rendimento foi desenvolvido. O método foi empregado para avaliar knockout gene Salmonella cepas mutantes de seus envolvimentos na interação patógeno-hospedeiro.

Resumo

Espécies de Salmonella são patógenos zoonóticos e principais causas de doenças de origem alimentar em humanos e animais domésticos ^1. A compreensão dos mecanismos subjacentes às interacções Salmonella -host são importantes para elucidar a patogênese molecular da infecção por Salmonella. O ensaio de proteção gentamicina para o fenótipo associação Salmonella, invasão e replicação em células fagocíticas foi adaptado para permitir a seleção de alto rendimento para definir os papéis dos mutantes de deleção de Salmonella enterica sorotipo Typhimurium em interações de host utilizando matérias 264,7 macrófagos murinos. Sob este protocolo, a variância em medições é significativamente reduzida em comparação com o protocolo padrão, porque o tipo selvagem e estirpes mutantes múltiplas pode ser testado no mesmo prato de cultura e, ao mesmo tempo. O uso de pipetas multicanal aumenta a produtividade e melhora a precisão. Além disso, as preocupações relacionadas com a utilização de menos host células por cavidade em 96 cavidades de cultura prato foram abordados. Aqui, o protocolo do ensaio modificado in vitro a invasão de Salmonella usando células fagocíticas foi empregue com sucesso para o fenótipo 38 individuais de Salmonella mutantes de deleção de associação, invasão e replicação intracelular. Os fenótipos in vitro são apresentados, alguns dos quais foram posteriormente confirmadas ter em fenotipos in vivo num modelo animal. Assim, a modificação, o ensaio padronizado para o fenótipo associação Salmonella, invasão e replicação em macrófagos com capacidade de alto rendimento poderia ser utilizada de forma mais ampla para estudar as interações de bactérias hospedeiras.

Introdução

Nontyphoidal Salmonella são importantes causas de doenças entéricas em todos os vertebrados. A salmonelose em humanos está entre as principais doenças de origem alimentar bacteriana ^1. Caracterização dos mecanismos moleculares que estão na base das interações de Salmonella com seus hospedeiros animais é alcançada principalmente através do estudo da Salmonella Typhimurium enterica sorotipo (STM) em modelos de cultura de tecidos e animais de infecção. Busca de insights nas interações STM-hospedeiro nos ajudará a entender como Salmonella sobreviver e crescer dentro das células hospedeiras. O primeiro desafio em estudar essas interações é identificar o maior número de fatores de participantes possível, tanto acolhimento e patógeno, mas estes esforços são em grande parte obstruída pelas dificuldades significativas de lidar com dois sistemas biológicos complexos independentes simultaneamente, ou seja, de acolhimento e de Salmonella, sob condições fisiológicas. Além disso, o grande Repertoirê de Salmonella e genes do hospedeiro potencialmente fatores envolvidos na interação hospedeiro codificam exigem alto throughput plataforma biológica para enfrentar este desafio.

A modificação, teste padronizado para o fenótipo associação Salmonella, invasão e replicação em macrófagos com capacidade de alto rendimento foi desenvolvido para examinar um grande conjunto de genes provavelmente envolvidos em interações Salmonella -host. O ensaio de protecção de gentamicina foi desenvolvido em 1973 ^2, mas foi completamente descrita em primeiro lugar, em 1994 por Elsinghorst ^3,4. Ela tornou-se uma ferramenta padrão para o estudo de muitos patógenos bacterianos intracelulares ex vivo, incluindo Salmonella ^5,6. Bactérias internalizadas evitar ser morto por alguns antibióticos, como a gentamicina, que não podem penetrar as células eucarióticas ^3. Tirando proveito desse fenômeno, o ensaio de proteção gentamicina mede a sobrevivência eo crescimento das ba intracelularpatógenos cterial. Três eventos durante a infecção, por exemplo, a associação com células eucarióticas, invasão e replicação, pode ser avaliada por agentes patogénicos bacterianos intracelulares, com base no intervalo de tempo entre a infecção, o tratamento de gentamicina, e após incubação (Figura 1). Linhagens de células eucarióticas proporcionar um ambiente fisiológico que é menos complexo do que os modelos animais relevantes para estudos de interação patógeno-hospedeiro.

O ensaio de proteção gentamicina é uma plataforma adequada para estudar as interações STM-hospedeiro, mas o ensaio padrão de 24 poços cultura prato tem capacidade baixa taxa de transferência. Análise computacional de conjuntos de dados in vivo identificou 149 produtos de genes Salmonella que estão previstos para interagir com cerca de 300 produtos de genes de acolhimento (dados não publicados). O ensaio de protecção de gentamicina padrão não tem a capacidade de fenótipo este número de mutantes de forma eficiente.

Em additião, o ensaio de protecção de gentamicina pode teoricamente detectar a invasão de mesmo uma única bactéria. Devido a esta sensibilidade inerente, os dados em bruto são susceptíveis a variações técnicas quando repetido em diferentes momentos. Os controles internos e de apresentação dos dados relativos após a normalização são essenciais para a interpretação significativa dos resultados. Dadas estas considerações, um ensaio de proteção gentamicina padronizado modificado foi desenvolvido para aumentar a capacidade de teste e aumentar a precisão.

O protocolo seguinte é pormenorizada e ilustrada de realizar o ensaio de protecção de gentamicina modificada de 96 poços utilizando placas de cultura e a linha celular RAW264.7 de macrófagos de murino. Comparado com o protocolo padrão em pratos de 24 poços de cultura, o protocolo modificado tem as seguintes vantagens: 1) Utilização de 96 poços de cultura de placas permite que até 10 estirpes mutantes diferentes para ser fenotipados incluindo os controlos positivos e negativos internos, com potência estatística suficiente;2) A variância dos resultados é significativamente reduzida, porque as estirpes mutantes são testados no mesmo prato de cultura e, ao mesmo tempo; 3) O uso de pipetas multicanal aumenta a produtividade enquanto reduz a fadiga do operador. Por último, em comparação com 24 poços placas de cultura, as preocupações de menos células hospedeiras por poço em 96 poços prato de cultura foram abordadas através de otimização de protocolos e padronização.

Em resumo, a modificação, o ensaio in vitro padronizado para Salmonella fenótipo ou outra associação bacteriana, invasão e replicação em células fagocíticas aumenta a precisão e alcança a capacidade de elevado rendimento, reduzindo a fadiga do operador.

Protocolo

1 Murino RAW264.7 de macrófagos Cultura celular

1. Grow baixo número passagem macrófagos murinos, RAW264.7 (O Número ATCC ^®, TIB-71) em um frasco de cultura de células T-tampa ventilada 75 no filtro de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) , 0,5% de _NaHCO3, e 1% de aminoácidos não essenciais 100X (NEAA), a 37 ° C, em 5% de uma incubadora de CO _2.
2. Depois das células atingirem uma confluência de 60-80% no frasco, utilizar um raspador de células para colheita de células, e contar as células num hemacitómetro e calcular a concentração de células.
3. Ressuspender as células e dilui-se a concentração de células em 2,5 x 10 ⁵ / ml em meio DMEM fresco de cultura de células. Use pipetas multicanal ao prato 200 ul de meio de cultura DMEM contendo célula 5 x 10 ⁴ células em cada poço de placas de 96 poços de cultura de células.
4. Placa quatro poços de cada cepa de Salmonella sp. Configure três placas separadas por um conjuntode ensaio de invasão de células fagocíticas, e marcá-los com "associação", "invasão" e "replicação", respectivamente.
5. Colocar as placas em 5% de _CO2 numa estufa a 37 ° C ON para permitir que as células de macrófagos para anexar ao fundo dos poços.

2 Preparação de Salmonella de tipo selvagem e mutantes

1. No mesmo dia, de preparar as células de macrófagos RAW264.7, escolher colónias individuais de tipo selvagem (WT) de Salmonella enterica sorotipo Typhimurium 14028s, DinvA mutantes, DphoP mutantes, e as cepas teste mutantes desejados e cultura-los em Luria-Bertani ( LB) suplementado com antibióticos, conforme apropriado. Use cada conjunto de ensaios de invasão de células fagocíticas para testar até 10 cepas mutantes (DinvA mutante e DphoP mutante estão com defeito na invasão e replicação intracelular, respectivamente).
2. Crescer as bactérias durante 14 horas a 37 ° C, com sHaking a 220 rpm, em 5 mL de cada um de caldo LB na frouxamente tapado 14 ml num tubo de polipropileno de fundo redondo. Caldo LB contém antibióticos apropriados, no nosso caso, a maior parte das estirpes mutantes são resistentes à canamicina, 50 mg / ml
3. No dia seguinte, cada uma das subculturas em culturas de estirpes de Salmonella em deslizamento 5 ml de caldo LB na proporção de 1:50 durante 4 horas adicionais, com agitação a 220 rpm.
4. Leia OD ₆₀₀ valores de cada cultura bacteriana em um espectrofotômetro, e cada leitura deve variar 0,6-1,2 para otimizar Salmonella ilha de patogenicidade-1 tipo III sistema de secreção (SPI-1 TTSS) a expressão do gene para a invasão.
5. Utilizar a fórmula de uma OD ₆₀₀ = 7,5 x 10 ⁸ CFU / mL para estimar a concentração de bactérias, em seguida, dilua bactérias para uma concentração de 5 x 10 ⁶ CFU / mL em DMEM fresco meio de cultura celular.

3 Ensaio de Invasão em 96 poços da placa Cultura

1. Remova três cel 96 poçosplacas de cultura de l a incubadora de CO ₂ e lavar uma vez com cada poço 200 ul de tampão PBS 1x.
2. Após a lavagem e a remoção completa de PBS, adicionar 200 uL de bactérias em meio DMEM (ver acima) para cada poço. Isto resulta em um x 10 ⁶ células de Salmonella em cada poço e multiplicidade de infecção (MOI) de 20: 1.
3. Centrifuga-se as placas a 1.000 xg num veículo selado, durante 10 min, em seguida substituir placas (tempo zero) de 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante 30 min. Para cada cepa, criou pelo menos quatro poços duplicados.
4. Após 30 min, remover placas do incubador e lavar três vezes com 200 ul de 1x PBS para remover as bactérias não associados.
5. Após a lavagem, exceto a placa marcado com "associação" para tratamento. Adicionar 200 ul de meio de DMEM contendo 100 ug / ml de gentamicina a cada poço das placas marcadas com "invasão" e "de replicação" em ordem to matar Salmonella extracelular. Devolver as placas a 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante uma hora adicional.
6. Guardar um poço de cada estirpe infectada para gravar a contagem de células de macrófagos, tratar o resto dos poços na placa de "associação" com 200 ul de 1x PBS contendo 1% de Triton X-100 durante 10 min. A solução de Triton irá lisar células de macrófagos e libertar Salmonella associada.
7. Colheita de Salmonella em cada poço e colocá-los em tubos de 1,5 ml de Eppendorf. Realize três 10 diluições vezes com 900μl 1x PBS sobre as amostras colhidas de cada poço, vortex é realizada entre cada diluição.
8. Placa a terceira diluição 10 ^-3, em ambos LB (WT) ou LB Kan (mutantes) placas. Rotular as placas com nome apropriado Salmonella tensão, número de diluição, ponto de hora e data.
9. Após turbilhonamento do terceiro tubo de diluição, dispensar amostra de 10 ul sobre a superfície do agar e repetição fnossos tempos para um total de 5 gotas. Certifique-se de espaço a cinco 10 mL cai uniformemente nas placas de Petri prato ^7.
10. Depois de absorver as gotas sobre o agar, as placas de transformar e incubar durante a noite a 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora.
11. Tratar poços guardados para a contagem de macrófagos com 150 1xPBS ul contendo 0,25% de Tripsina-EDTA durante 10 minutos.
12. Após tripsinização, macrófagos lugar em tubos de 1,5 ml de Eppendorf e tratá-los com 50 mL de FBS para neutralizar a solução de tripsina / EDTA, corar as células com 0,4% de azul de Tripan e marcou-los através da utilização de hemacitómetro.
13. Quando a incubação de uma hora tenha decorrido, remova a "invasão" e placas de "replicação" da incubadora de CO _2, e lavar cada bem como "Passo 3.4".
14. Guarde a placa de "invasão" de tratamento adicional como "Passo 3,6-3,12".
15. Adicionar 200 ul de meio DMEM contendo 10 ug / ml de gentamicina aa placa "de replicação" para manter a distância de Salmonella no meio extracelular. Retornar a placa a 37 ° C, 5% de CO ₂ para uma incubadora de 22,5 horas adicionais.
16. No dia seguinte, remove a placa "de replicação" de 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora, e lava-se cada poço como "Passo 3.4" e tratá-los como "Passo 3,6-3,12".
17. Por fim, retire as placas de agar após incubação durante a noite em 37 ° C incubadora e marcar o número de colônias de bactérias.
18. A distribuição boa colônia deve estar entre 10 e 100 colônias, cada ponto contém cerca de 2 a 20 colônias, que seria difícil de marcar, se houvesse mais de 20 colônias em um ponto. Se a contagem é muito baixa ou muito alta, replate a amostra com 10 diluições mais altas ou mais baixas, conforme necessário.

Análise 4. Dados

1. Calcular os (unidades formadoras de colônia por ml) CFU de cada placa com base no costadovolume e factor de diluição.
2. Determina-se o número de Salmonella por macrófagos através da contagem de células de macrófagos registada a partir de cada estirpe.
3. Calcular as médias geométricas de CFU por macrófagos a partir de pelo menos três experiências independentes para a associação celular, invasão ou replicação, respectivamente, e ainda mais para normalizar o WT para o valor relativo.
4. Analisar os dados de associação, invasão e replicação por teste t de Student, respectivamente, comparando cada cepa de WT, e determinar a significância estatística pelo valor p.

Resultados

Veja resultados representativos (Figura 2) após os dados são plotados com base no ensaio de invasão de células fagocíticas modificado. Os dados incluem cinco estirpes diferentes, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A e B. mutante Δ invA, conhecido por ser defeituoso para a invasão, e ΔphoP conhecido por ser defeituoso para a replicação ^8, são usados ​​como controles positivos para avaliar a validade experimental . Com efeito, no ensaio de invasão modificado,...

Discussão

O ensaio de protecção de gentamicina é amplamente utilizado para estudar a invasão e replicação de agentes patogénicos bacterianos intracelulares dentro da célula hospedeira, e é especialmente uma ferramenta importante para o estudo de organismos patogénicos biológico, como a Salmonella, cuja invasão é o passo de pré-requisito para o estabelecimento de infecção ^{de 1.} O ensaio padrão de proteção gentamicina na comunidade de pesquisa Salmonella é implementado em 24 bem plac...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965
Fetal bovine serum	HyClone	SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap	Nest Biotechnology	708003
100x Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140
Cell scraper	BD Falcon	353086
96-well Cell culture plate	Corning Incorporated	3595
Luria-Bertani (LB) broth	MP Biomedicals	3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube	BD Falcon	352059
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamycin solution	Sigma	K0254
Gentamicin solution	Sigma	G1272
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200
Trypan blue	Sigma	T8154