高通量检测到的表型<em&gt;沙门氏菌</em&gt;伤寒协会，侵袭和复制的巨噬细胞

摘要

高通量测定法在体外表现型沙门氏菌或其他细菌的关联，侵袭和吞噬细胞与高通量能力的复制被开发。该方法来评估沙门氏菌基因敲除突变株的宿主-病原体相互作用的参与。

摘要

沙门氏菌是人畜共患的病原体，并在人类和牲畜¹食源性疾病的主要原因。了解潜在的沙门氏菌 -host相互作用的机制是很重要的澄清沙门氏菌感染的分子发病机制。在庆大霉素保护测定表型沙门氏菌协会，侵袭和复制在吞噬细胞被适配为允许高通量筛选中使用的RAW 264.7鼠巨噬细胞宿主的相互作用限定的沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌的缺失突变体的作用，在这种协议中，方差在测量相对于标准协议显著降低，因为野生型和多种突变株所用的相同的培养皿中，并在同一时间进行测试。使用多道移液器的增加的吞吐量并提高精度。此外，关注与使用较少豪每孔ST细胞在96孔培养皿中分别处理。在此，修改后的体外沙门氏菌侵袭使用吞噬细胞检测的协议被成功地应用到表型38个人沙门氏菌缺失突变体的关联，入侵和细胞内复制。 在体外表现型呈现，其中一些随后被证实具有体内表型的动物模型。因此，修饰的，标准化的检测，以表型沙门氏菌协会，侵袭和复制中的巨噬细胞与高通量的能力，可以利用更广义地来研究细菌-宿主相互作用。

引言

非伤寒沙门氏菌是所有脊椎动物肠道疾病的重要原因。沙门氏菌在人类是顶级的细菌经由食物传染的疾病^，1间。该支撑沙门氏菌的互动与他们的动物宿主的分子机制的表征是通过沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌（STM）在感染的组织培养和动物模型的研究，主要实现的。争取在STM-宿主相互作用的见解将帮助我们了解沙门氏菌如何生存和发展的宿主细胞内。在研究这些相互作用的第一个挑战是要找出尽可能多的参与因素可能来自宿主与病原体，但这些努力在很大程度上阻碍了两个独立的复杂生物系统同时处理， 即主机和沙门氏菌的显著困难， 在生理条件下。此外，大repert沙门氏菌 oire和宿主基因可能编码参与宿主相互作用的因素需要高通量生物平台来解决这个难题。

一种改进的，标准化的检测表型沙门氏菌的关联，入侵和复制的巨噬细胞具有高吞吐能力的开发，研究大组基因可能参与沙门氏菌 -host互动。庆大霉素保护法于1973年²开发的，但第一次彻底Elsinghorst在1994年^3,4描述。如今，它已成为研究细胞内的许多细菌病原体在体外 ，包括沙门氏菌 ^5,6的标准工具。内在的细菌避免被打死一些抗生素，如庆大霉素，无法穿透真核细胞^3。通过利用这种现象的优点，该庆大霉素保护法测量细胞内巴的存活和生长cterial病原体。在感染过程中三个事件， 即与真核细胞浸润和复制相关联，可以评价为基于感染，庆大霉素处理，并进一步温育（ 图1）之间的时间间隔内的细菌病原体。真核细胞系提供了生理环境比相关的动物模型宿主 - 病原体相互作用的研究那么复杂。

在庆大霉素保护测定是适当的平台来研究STM-宿主的相互作用，但在24孔培养皿中的标准测定具有低吞吐量。 体内数据集的计算分析确定的被预测到大约300宿主基因产物（未发表数据）进行交互149 沙门氏菌基因产物。标准庆大霉素保护测定不具有有效地表现型的突变体的这一数量的能力。

在乳房清洁度离子，庆大霉素保护法理论上可以检测到入侵，甚至一个单一的细菌。因为这个固有的敏感性，当在不同时间重复的原始数据是容易的技术差异。内部控制及标准化后的相对数据呈现对于结果的有意义的解释是必不可少的。鉴于这些考虑，改良，标准化庆大霉素保护法的开发，以提高检测能力，提高精确度。

下面的协议是详尽和图示来执行使用96孔培养皿中，并在小鼠巨噬细胞的RAW264.7细胞系的改性庆大霉素保护测定。相比于在24孔培养皿中的标准协议，修改后的协议具有以下优点:1）使用96孔培养皿允许多达10个不同的突变体菌株进行表型，包括以足够的统计功率内部阳性对照和阴性对照;2）结果的方差显著降低，因为该突变株在相同的培养皿中，并在同一时间进行测试; 3）采用多道移液器的增加吞吐量，同时减少操作员的疲劳。最后，比较于24孔培养皿中，每孔少的宿主细胞在96孔培养皿中的关注通过协议优化和标准化得到解决。

在摘要中，改性的，标准化的检测，以在体外表现型沙门氏菌或其他细菌的关联，侵袭和复制在吞噬细胞中增加精度，并实现高通量的能力，同时降低了操作者的疲劳。

研究方案

1，小鼠巨噬细胞巨噬细胞培养

1. 成长低通道数小鼠巨噬细胞，RAW264.7（ATCC得到^®数，TIB-71）中的T-75细胞培养瓶中排出过滤器中的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），补充有10％胎牛血清的帽（FBS）的，0.5％的NaHCO _3，和1％的100×非必需氨基酸（NEAA）在37℃下，在5％CO ₂的培养箱中培养。
2. 一旦细胞达到60-80％汇合烧瓶中，用细胞刮刀收获细胞，细胞计数的血球并计算细胞浓度。
3. 重悬细胞，并稀释细胞浓度为2.5×10 ⁵个/ ml，在新鲜的DMEM细胞培养基中。使用多道移液器于板加入200μl含有5×10 ⁴个细胞在96孔细胞培养板的每个孔的DMEM细胞培养基中。
4. 板四口井每沙门氏菌菌株。设立了三个独立的板块为一组吞噬细胞侵袭实验，并与"联想"，"入侵"和"复制"标记它们分别。
5. 放置在5％CO ₂培养箱中培养板在37℃下接通，使巨噬细胞的细胞附着到孔的底部。

2，制备的沙门氏菌野生型和突变体

1. 上制备的巨噬细胞的RAW264.7细胞的同一天，挑单菌落的野生型（WT）的沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌14028s，DinvA突变，DphoP突变体，并且所期望的测试突变体菌株，并对其进行培养的Luria-Bertani（ LB）肉汤中添加抗生素为宜。使用每一组的吞噬细胞侵袭测定法来测试多达10个突变体菌株（DinvA突变体和DphoP突变体是有缺陷的侵入和细胞内复制，分别）。
2. 生长细菌14小时，在37℃以s以220rpm在圆底管克竞在每个LB肉汤5毫升在松瓶盖14毫升聚丙烯。 LB培养基中含有适当的抗生素，在我们的案例中，大多数突变株耐卡那霉素，50微克/毫升
3. 第二天，另外4小时振摇在220rpm传代培养每一个的导通沙门氏菌菌株的纯5ml的LB培养液以1:50的比例的培养物。
4. 阅读外径每个细菌培养价值₆₀₀分光光度计上，每读取范围应为0.6-1.2，优化沙门氏菌毒力岛1 III型分泌系统的入侵（SPI-1 TTSS）基因的表达。
5. 使用1 OD式₆₀₀ = 7.5×10 ⁸ CFU / ml的估算细菌浓度，然后稀释细菌为5×10 ⁶ CFU / ml，在新鲜的DMEM细胞培养基中的浓度。

3，侵袭实验在96孔培养板

1. 删除3 96孔CEL从CO ₂培养箱升培养板和洗涤各孔一次，用200微升的1×PBS缓冲液中。
2. 洗涤并完全除去PBS后，加入200μl的细菌在DMEM培养基（见上文）到每个孔中。这导致在1×10 ⁶个沙门氏菌属细胞在各孔中，感染复数为20的（MOI）:1。
3. 离心反应板在1,000 XG在一个密封的载体为10分钟，然后在37℃，5％CO ₂培养箱更换板（零时间）为30分钟。对于每种菌株，设置至少四个重复孔中。
4. 30分钟后，从培养箱中取出盘子和洗三次，加入200μl1×PBS中，以除去未关联的细菌。
5. 洗涤后，保存标有"协会"接受进一步治疗的板块。加入200微升含有100微克/毫升庆大霉素到标有"入侵"和"复制"的板的每个孔中的DMEM培养基，以吨Ø杀死沙门氏菌外，返回板块至37℃，5％CO2 _培养箱额外小时。
6. 保存一个孔从每个感染的菌株，用于记录巨噬细胞数，治疗的"关联"板用200μl1×PBS中的含有1％Triton X-100的10分钟，孔的剩余部分。海卫的解决方案将裂解巨噬细胞的细胞并释放相关的沙门氏菌 。
7. 嘉实沙门氏菌从每口井，把它们用1.5毫升的Eppendorf管中。从每个孔收获的样品进行3个10倍连续稀释液与900μL的1×PBS中，每个稀释度之间进行涡流。
8. 板第三稀释^，10-3，在任磅（WT）或LB侃（突变体）板。标记与相应的沙门氏菌菌株名称，稀释号码，时刻和日期的平板上。
9. 涡旋第三稀释管后，取10微升样品在琼脂和重复f的表面上我们的时代，共5滴。请务必空间五10微升滴均匀地涂在培养皿板^7。
10. 滴后浸泡到琼脂中，在转动板孵育过夜，在37℃，5％CO ₂的培养箱中培养。
11. 治疗保存为巨噬细胞用含有0.25％胰蛋白酶-EDTA的10分钟加入150μl1XPBS的数量的井。
12. 胰蛋白酶消化后，将巨噬细胞用1.5毫升的Eppendorf管中，并把它们与50微升的FBS中和胰蛋白酶/ EDTA溶液，将细胞染色用0.4％台盼蓝，并通过使用血球得分它们。
13. 当1小时孵化过后，从CO ₂培养箱中删除"侵略"和"复制"板块，并洗好每一个为"3.4步"。
14. 拯救"入侵"板块作进一步处理"工序3.6-3.12"。
15. 加入200μl的DMEM培养基中含有10微克/毫升庆大霉素到在"复制"板块，以维持细胞外介质中沙门氏菌的间隙。返回板以37℃，5％CO ₂培养箱中培养额外22.5小时。
16. 第二天_{，37℃，5％CO2}培养箱中取出"复制"字牌，而每次洗以及"3.4步"，并把他们当作"步骤3.6-3.12"。
17. 最后，过夜培养后取出琼脂平板在37℃培养箱中培养和得分的细菌菌落的数量。
18. 良好的菌落分布应为10至100个菌落，每个点约含有2〜20个菌落，这将是很难的得分，如果有超过20个菌落在一个点上。如果计数太低或太高，replate与样品需要10倍的更高或更低的稀释液。

4，数据分析

1. 计算基于所镀的菌落形成单位（每毫升菌落形成单位），每块板的体积和稀释因子。
2. 通过从每种菌株的记录，巨噬细胞的细胞计数确定每巨噬细胞的沙门氏菌的数量。
3. 从为小区关联，浸润或复制，至少三次独立实验计算每巨噬细胞菌落形成单位的几何平均数分别，进一步正常化到WT的相对值。
4. 分别分析用Student t检验进行关联，侵袭和复制的数据，通过比较各菌株与WT，并确定由p值的统计学意义。

结果

见代表性结果（ 图2）中的数据是基于改性的吞噬细胞侵袭测定作图后。该数据包括五个不同的菌株，WT，ΔinvA，ΔphoP，突变体A和突变体BΔinvA的 ，已知为有缺陷的入侵，并ΔphoP已知为有缺陷的复制^8，被用作阳性对照，以评估试验有效性。的确，在本变形侵袭测定法，ΔinvA突变甚少内在由RAW264.7细胞和ΔphoP突变已24小时后减少复制。突变体A和B?...

讨论

在庆大霉素保护法被广泛地用于研究的侵袭宿主细胞内的细胞内细菌病原体和复制，并且它是特别重要的生物学工具用于研究的病原体，如沙门氏菌 ，其侵袭是用于建立感染¹的前提步骤。 沙门氏菌研究界的标准庆大霉素保护法在24孔培养皿⁵来实现。虽然使用48或者甚至96孔板中之前讨论的用于高通量能力^9，没有实际的协议已被证明在细节和成功地用于测试?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965
Fetal bovine serum	HyClone	SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap	Nest Biotechnology	708003
100x Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140
Cell scraper	BD Falcon	353086
96-well Cell culture plate	Corning Incorporated	3595
Luria-Bertani (LB) broth	MP Biomedicals	3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube	BD Falcon	352059
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamycin solution	Sigma	K0254
Gentamicin solution	Sigma	G1272
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200
Trypan blue	Sigma	T8154