Высокая пропускная Анализ фенотипу<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах

Резюме

Была разработана с высокой пропускной анализ, чтобы в пробирке фенотипа сальмонеллами или другой бактериальной ассоциации, вторжения и репликации в фагоцитов с высокой пропускной способностью. Метод был использован для оценки Salmonella ген нокаут мутантных штаммов для их вовлеченности в хозяин-патоген взаимодействий.

Аннотация

Salmonella виды патогенов и ведущими причинами продуктами болезней у людей и скота ^1. Понимание механизмов, лежащих в основе сальмонеллы -host взаимодействия важны для выяснения молекулярного патогенеза сальмонеллеза. Анализ защиты гентамицин фенотипу Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в фагоцитирующих клеток был адаптирован, чтобы позволить высокой скрининг для определения роли мутантов с делецией Salmonella enterica серотипа Typhimurium в принимающих взаимодействий с использованием RAW 264,7 мышиных макрофагов. Согласно этому протоколу, дисперсию измерений существенно снижается по сравнению со стандартным протоколом, так как дикого типа, и множество мутантные штаммы могут быть проверены в той же культуральной чашке, и в то же время. Использование многоканальных пипеток увеличивает пропускную способность и повышает точность. Кроме того, опасения в связи с использованием менее хоул клеток на лунку в культуральной чашке 96-а были адресованы. Вот, протокол модифицированного пробирке Salmonella вторжения анализа при помощи фагоцитоза клетки был успешно применен для фенотип 38 индивидуальных Salmonella делеционных мутантов для объединения, вторжения и внутриклеточной репликации. В фенотипы в пробирке представлены, некоторые из которых впоследствии были подтверждены, чтобы иметь в естественных фенотипов в животной модели. Таким образом, изменение, стандартные тесты на фенотип Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в макрофагах с высокой пропускной мощности могут быть использованы в более широком смысле для изучения бактериально-хост взаимодействий.

Введение

Nontyphoidal Salmonella являются важными причинами кишечных заболеваний у всех позвоночных. Сальмонеллез у человека является одним из главных бактериальных болезней пищевого происхождения ^1. Характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия Salmonella со своими хозяевами животных в основном достигается через изучение Salmonella enterica серотипа Typhimurium (СТМ) в культуре ткани и животных моделях инфекции. Получение понимание в STM-хост взаимодействий поможет нам понять, как Salmonella выжить и развиваться внутри клеток-хозяев. Первая задача в изучении этих взаимодействий является определить, как много участвующих факторов, а от хозяина и патогена, но эти усилия в значительной степени препятствуют значительные трудности дело с двумя независимыми сложных биологических систем одновременно, то есть, хост и сальмонеллы, при физиологических условиях. Кроме того, большое Repertoire сальмонеллы и гены хозяина потенциально кодирующие факторы, участвующие в принимающих взаимодействий требуют высокой пропускной биологическую платформу для решения этой проблемы.

Изменение, стандартные тесты на фенотип Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в макрофагах с высокой пропускной способностью был разработан для изучения большой набор генов, вероятно, занимающихся Salmonella -host взаимодействий. Анализ защиты гентамицин был разработан в 1973 году ^2, но впервые была тщательно описывается Elsinghorst в 1994 ^3,4. Теперь это стало стандартным инструментом для изучения многих внутриклеточных бактериальных патогенов экс естественных условиях, в том числе сальмонеллы ^5,6. Интернализованная бактерии избегают гибели от некоторых антибиотиков, таких как гентамицин, что не могут проникнуть эукариотических клеток ^3. Воспользовавшись этим явлением, анализ защиты гентамицин измеряет выживания и роста внутриклеточных баcterial патогены. Три события в период инфекции, т.е. связь с эукариотических клеток, инвазии и репликации, может быть оценена для внутриклеточных бактериальных патогенов на основе временного интервала между инфекции, лечения гентамицин, и дальнейшей инкубации (рисунок 1). Эукариотической клетки линии обеспечивают физиологическую среду, которая является менее сложным, чем соответствующих животных моделях для исследования взаимодействия хост-патогена.

Защита анализа Гентамицин является подходящей платформой для изучения СТМ-хост взаимодействий, но стандарт анализа в культуральной чашке 24-луночного имеет низкую пропускную способность. Автоматическая обработка естественных условиях наборов данных в идентифицированы 149 генов сальмонеллы продукты, которые, по прогнозам, взаимодействовать с приблизительно 300 генов хозяина продукции (неопубликованные данные). Стандарт гентамицин анализ защиты не имеют возможности фенотип это число мутантов эффективно.

В Additионный, анализ защиты гентамицин теоретически может обнаружить вторжение даже одной бактерии. Из этой присущей чувствительности, необработанные данные восприимчивы к техническим дисперсий, когда повторяется в разные моменты времени. Внутренние органы управления и относительная представление данных после нормализации имеют важное значение для содержательной интерпретации результатов. Учитывая эти соображения, изменение, стандартизированная гентамицин защиты был разработан анализ, чтобы добавлять потенциала по тестированию и повышают точность.

Следующий протокол подробно и показано для выполнения измененного гентамицина защиты анализа, используя блюда культуры 96-а и мышиный линию макрофагов RAW264.7 клеток. По сравнению со стандартным протоколом в чашки для культивирования с 24 лунками, модифицированный протокол имеет следующие преимущества: 1) Использование тарелки культуры 96-а позволяет до 10 различных мутантных штаммов, которые будут phenotyped в том числе внутренних положительных и отрицательных контролей с достаточной статистической мощности;2) Дисперсия результатов значительно снижается, потому что мутантные штаммы тестируют в той же культуральной чашке, и в то же время; 3) Использование многоканальных пипеток увеличивает пропускную при одновременном снижении утомляемости оператора. Наконец, по сравнению с блюдами культуры 24-а, опасения менее клетках-хозяевах на лунку в культуральной чашке 96-а были адресованы путем оптимизации протокола и стандартизации.

Таким образом, изменение, стандартные тесты, чтобы в пробирке фенотипа Salmonella или другой бактериальной ассоциации, инвазию и репликации в фагоцитирующих клеток повышает точность и достигает высокой пропускной способности при одновременном снижении усталости оператора.

протокол

1 Мышиные макрофагов RAW264.7 Культура клеток

1. Grow с низким числом пассажей мышиных макрофагов, RAW264.7 (АТСС номер ^®, TIB-71) в Т-75 колбу для культивирования клеток вентилируемые крышки фильтра в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , 0,5% NaHCO _3, и 1% 100x заменимые аминокислоты (NEAA) при 37 ° С, в 5% CO ₂ инкубаторе.
2. После того, как клетки достигают 60-80% слияния в колбе, использовать клеточным скребком для сбора клеток и подсчета клеток в гемацитометре и рассчитать концентрацию клеток.
3. Ресуспендируют клеток и разбавить концентрацию клеток в 2,5 х 10 ⁵ / мл в свежей DMEM среде для культивирования клеток. Использование многоканальные пипетки к пластине 200 мкл DMEM клеточной культуральной среде, содержащей 5 × 10 ⁴ клеток в каждую лунку клеточных культур 96-луночных планшетах.
4. Тарелка четыре лунки каждого штамма Salmonella. Настройте три отдельные пластины для одного наборафагоцитарной клетки вторжения анализа, и отмечать их с "ассоциации", "вторжения" и "репликации", соответственно.
5. Место пластин в 5% CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ° C ON, чтобы позволить макрофагов клеткам прикрепляться к нижней части скважины.

2 Получение Salmonella дикого типа и мутантов

1. В тот же день подготовки макрофагов RAW264.7 клетки, подобрать отдельных колоний дикого типа (WT) Salmonella enterica серотипа Typhimurium 14028s, DinvA мутантные, DphoP мутантные, и желаемые штаммы тест мутантные, и культура их в Лурия-Bertani ( LB), в бульоне с добавлением антибиотиков по мере необходимости. С помощью каждого набора из фагоцитирующих клеток вторжения анализов, чтобы проверить до 10 мутантных штаммов (DinvA мутанта и DphoP мутант являются дефектными в инвазии и внутриклеточной репликации, соответственно).
2. Расти бактерии в течение 14 ч при 37 ° С с Shaking при 220 оборотах в минуту в 5 мл каждого из LB бульоне в слабо ограничен 14 мл полипропилена в трубе с круглым дном. LB бульон содержит соответствующие антибиотики, в нашем случае, большинство мутантных штаммов устойчивы к канамицину, 50 мкг / мл
3. На следующий день, субкультура каждый из О культур штаммов Salmonella в равнинных 5 мл LB бульонов в соотношении 1:50 в течение дополнительного 4 ч при встряхивании при 220 оборотах в минуту.
4. Считайте ОП ₆₀₀ значения каждого бактериальной культуры на спектрофотометре, и каждый чтения должна составлять от 0,6-1,2 оптимизировать Salmonella патогенности остров-1 Тип III системы секреции (SPI-1 ЧТС) экспрессию генов для вторжения.
5. С помощью формулы 1 OD ₆₀₀ = 7,5 х 10 ⁸ КОЕ / мл для оценки бактериальной концентрации, а затем разбавленным бактерий в концентрации 5 × 10 ⁶ КОЕ / мл в свежей DMEM среде для культивирования клеток.

3 Вторжение анализа в культуре 96-луночного планшета

1. Удалите три CEL 96-ал культуральные планшеты от CO ₂ инкубаторе и мыть каждый хорошо раз с 200 мкл 1x PBS буфера.
2. После промывки и полного удаления PBS, 200 мкл бактерий в среде DMEM (смотри выше) в каждую лунку. Это приводит к 1 × 10 ⁶ Salmonella клеток в каждой лунке и множественности инфекции (MOI) 20: 1.
3. Центрифуга пластин при 1000 мкг в в запечатанном перевозчика в течение 10 мин, затем заменить пластины (нулевое время) в 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора в течение 30 мин. Для каждого штамма, настроить по меньшей мере четыре дублирующих скважин.
4. Через 30 мин удалить пластины из инкубатора и мыть три раза 200 мкл 1х PBS, чтобы удалить связанные с отпе- чатками бактерии.
5. После мытья, сохранить пластину с надписью с "ассоциации" для дальнейшего лечения. Добавить 200 мкл DMEM среде, содержащей 100 мкг / мл гентамицина в каждую лунку на планшетах со значком "вторжения" и "репликации" для того, Tо убить внеклеточный сальмонеллы. Вернуться пластин до 37 ° С, 5% СО ₂ инкубатора для дополнительного часа.
6. Сохранить один хорошо от каждого зараженного штаммом для записи количество макрофагов клеток, лечения остальную часть скважин на "объединение" пластины с 200 мкл 1x PBS, содержащим 1% Triton X-100 в течение 10 мин. Решение Triton будет лизировать макрофагов клетки и выпустить связанный сальмонеллы.
7. Урожай сальмонеллы из каждой лунки и поместить их в 1,5 мл пробирки Эппендорфа. Выполнение три 10-кратный серийных разведений с 900μl 1x PBS на собранных образцов из каждой лунки, вихревое выполняется между каждого разведения.
8. Тарелка третий разбавление, 10 ^-3, по обе LB (WT) или LB Кан (мутанты) пластин. Этикетка плиты с соответствующим названием Salmonella штамма, номер разбавления, момент времени и даты.
9. После встряхивания третий трубку разбавления, обойтись образца 10 мкл на поверхность агара и повторного Fнаши раз в общей сложности 5 капель. Обязательно пространстве пять 10 мкл капли равномерно на блюдо чашки Петри ^7.
10. После капель впитаться в агаре, повернуть пластины снова и инкубировать в течение ночи при 37 ° С, 5% СО ₂ инкубаторе.
11. Treat скважин, сохраненные для подсчета макрофагов с 150 мкл 1xPBS, содержащей 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 10 мин.
12. После обработки трипсином, макрофаги место в 1,5 мл пробирки Эппендорфа и относиться к ним с 50 мкл ФБС, чтобы нейтрализации трипсина / EDTA раствора, краситель клеток с 0,4% трипанового синего и оценка их через помощью гемацитометра.
13. Когда один час инкубации истекло, удалить "вторжение" и "репликации" тарелки из CO ₂ инкубаторе, и мыть каждый также "Шаг 3,4".
14. Сохраните "вторжение" пластины для дальнейшего лечения, как "Шаг 3.6-3.12".
15. Добавить 200 мкл DMEM, содержащей 10 мкг / мл гентамицина к"репликация" пластина для поддержания зазора внеклеточного Salmonella в среде. Вернуться пластину до 37 ° С, 5% СО ₂ инкубатора для дополнительного 22,5 часов.
16. На следующий день, удалить "репликации" тарелку от 37 ° С, 5% СО ₂ инкубатора, и мыть каждый также "Шаг 3,4" и рассматривать их как "Шаг 3.6-3.12".
17. Наконец, удалите агаром после инкубации в течение ночи в 37 ° С инкубатор и забьет количество бактериальных колоний.
18. Хорошее распределение колония должна быть между 10 и 100 колоний, каждое пятно примерно содержит от 2 до 20 колоний, было бы трудно забить, если бы было больше, чем 20 колоний на одном месте. Если количество слишком низко или слишком высоко, replate образца с 10-кратным высокие или более низкие разведения по мере необходимости.

Анализ 4. данных

1. Вычислить (единиц формирования колонии на мл) КОЕ каждого пластины, основанные на обшивкеОбъем и коэффициент разбавления.
2. Определить количество Salmonella в макрофагах путем записанного подсчета клеток макрофагов из каждого штамма.
3. Рассчитать геометрические средства КОЕ на макрофагах, по крайней мере в трех независимых экспериментах на ассоциации клеток, инвазии или репликации, соответственно, и нормализовать дальше на WT для относительной стоимости.
4. Проанализируйте данные для объединения, вторжения и репликации от Студенческого т -test соответственно, путем сравнения каждого штамма к WT, и определения статистической значимости по р-значение.

Результаты

Смотреть репрезентативные результаты (Рисунок 2) после того, как данные представлены на основе модифицированного фагоцитарной вторжения клеток анализа. Данные включают в себя пять различных штаммов, Вт, ΔinvA, ΔphoP, мутант A, и мутант Б. Δ Инва, как известно, неисправен дл?...

Обсуждение

Анализ защиты Гентамицин широко используется для изучения вторжение и репликации внутриклеточных бактериальных патогенов внутри клетки-хозяина, и это особенно важным биологическим инструментом для изучения патогенов, как сальмонелла, чьи вторжение является предпосылкой шаг д?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965
Fetal bovine serum	HyClone	SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap	Nest Biotechnology	708003
100x Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140
Cell scraper	BD Falcon	353086
96-well Cell culture plate	Corning Incorporated	3595
Luria-Bertani (LB) broth	MP Biomedicals	3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube	BD Falcon	352059
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamycin solution	Sigma	K0254
Gentamicin solution	Sigma	G1272
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200
Trypan blue	Sigma	T8154