Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Summary

Assay תפוקה גבוהה לסלמונלה במבחנה פנוטיפ או עמותת חיידקים אחרת, פלישה, ושכפול בתאי phagocytic עם קיבולת תפוקה גבוהה פותח. השיטה הועסקה כדי להעריך זנים מוטנטים נוקאאוט גן סלמונלה למעורבותם באינטראקציות מאכסן לפתוגן.

Abstract

מיני סלמונלה הם פתוגנים zoonotic וגורמים המובילים למחל מזון מובל בבני אדם ובעלי החיים ^1. הבנת המנגנונים בבסיס אינטראקציות -host סלמונלה הם חשובים על מנת להבהיר את הפתוגנזה המולקולרית של זיהום סלמונלה. Assay ההגנה גנטמיצין לפנוטיפ עמותת סלמונלה, פלישה ושכפול בתאי phagocytic הותאם כדי לאפשר הקרנת תפוקה גבוהה כדי להגדיר את התפקידים של מוטציות מחיקה של Typhimurium serotype enterica סלמונלה באינטראקציות מארח באמצעות 264.7 מקרופאגים עכבריים RAW. לפי פרוטוקול זה, את השונות במדידות מצטמצמת משמעותית בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי, כי wild-type וזנים מוטנטים מרובים, ניתן לבדוק באותו צלחת התרבות ובו בזמן. השימוש בטפטפות רבת ערוצים מגביר את התפוקה ומשפרת דיוק. יתר על כן, חששות הקשורים לשימוש בפחות הותאי st לכל גם בצלחת תרבות 96 היטב טופלו. הנה, בפרוטוקול של במבחנה assay פלישת סלמונלה שונה באמצעות תאי phagocytic הועסק בהצלחה לפנוטיפ 38 מוטציות מחיקת סלמונלה פרטניות לעמותה, פלישה ושכפול תאיים. פנוטיפים במבחנה מוצגים, שחלקם אישרו לאחר מכן יש בפנוטיפים vivo במודל חיה. לפיכך, assay שונה, הסטנדרטי לפנוטיפ סלמונלה עמותה, פלישה ושכפול במקרופאגים עם קיבולת תפוקה גבוהה יכולה להיות מנוצלת באופן רחב יותר כדי לחקור אינטראקציות חיידקים-מארח.

Introduction

Nontyphoidal סלמונלה הן גורמים חשובים במחל מעיים בכל החוליות. סלמונלה בבני האדם היא בין המחלות שמקורן במזון חיידקים העליונים ^1. אפיון של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות של סלמונלה עם מארחי בעלי החיים שלהם מושגת בעיקר באמצעות המחקר של סלמונלה typhimurium serotype enterica (STM) במודלים של בעלי החיים תרבות ורקמות של זיהום. תובנה באינטראקציות STM-מארח תעזור לנו להבין איך סלמונלה לשרוד ולגדול בתוך תאי מארח. האתגר הראשון בחקר האינטראקציות אלה הוא לזהות גורמים המשתתפים רבים ככל האפשר משני מארח ופתוגן, אבל המאמצים הללו מופרים בעיקר על ידי הקשיים המשמעותיים של התמודדות עם שתי מערכות ביולוגיות מורכבות עצמאיות בו זמנית, כלומר, מארח וסלמונלה, בתנאים פיסיולוגיים. בנוסף, repert הגדולoire של סלמונלה וגני מארח פוטנציאלי קידוד גורמים מעורבים באינטראקציות מארח דורשים פלטפורמה ביולוגית תפוקה גבוהה כדי להתמודד עם אתגר זה.

Assay שונה, סטנדרטי לפנוטיפ עמותת סלמונלה, פלישה ושכפול במקרופאגים עם קיבולת תפוקה גבוהה פותח כדי לבחון קבוצה גדולה של גנים סביר העוסקים ביחסי גומלין -host סלמונלה. Assay ההגנה גנטמיצין פותח בשנת 1973 ^2, אבל ראשון שתואר ביסודיות על ידי Elsinghorst ב -1994 ^3,4. עכשיו זה הפך להיות כלי סטנדרטי ללימוד רב פתוגנים תאיים חיידקי vivo לשעבר, כולל סלמונלה ^5,6. חיידקים הפנימו להימנע מלהיות נהרגו על ידי כמה אנטיביוטיקה, כמו גנטמיצין, שלא יכול לחדור לתאים אוקריוטים ^3. על ידי ניצול של תופעה זו, assay הגנת גנטמיצין מודד את ההישרדות וצמיחה של ba תאייםפתוגנים cterial. שלושה אירועים במהלך הזיהום, כלומר, שיתוף עם תאים, פלישה ושכפול אוקריוטים, ניתן להעריך לחיידקים פתוגנים תאית המבוססים על מרווח הזמן בין זיהום, טיפול גנטמיצין, ודגירה נוספת (איור 1). שורות תאים אוקריוטים לספק סביבה פיזיולוגית שהיא פחות מורכב ממודלים של בעלי חיים רלוונטיים ללימודי אינטראקציה המאכסן לפתוגן.

Assay ההגנה גנטמיצין הוא פלטפורמה מתאימה כדי לחקור אינטראקציות STM-מארח, אבל assay הסטנדרטי בצלחת תרבות 24 גם יש קיבולת נמוכה תפוקה. אנליזה חישובית של in vivo מערכי נתונים מזוהה 149 מוצרי גן סלמונלה שהם חזו אינטראקציה עם כ 300 מוצרי גן המארח (נתונים שלא פורסמו). Assay ההגנה גנטמיצין הסטנדרטי אין את יכולת פנוטיפ מספר זה של מוטציות ביעילות.

בadditיון, assay הגנת גנטמיצין יכול באופן תיאורטי לזהות הפלישה של אפילו חיידק בודד. בגלל רגישות טבעית זו, את הנתונים הגולמיים רגישים לסטיות טכניות כאשר חזרו בזמנים שונים. הבקרות הפנימיות ולהצגה נתונים היחסית לאחר הנורמליזציה חיוניות לפרשנות משמעותית של התוצאות. בהתחשב בשיקולים אלה,, assay הגנת גנטמיצין הותאם סטנדרטי פותח כדי לשפר את יכולת בדיקה ולהגדיל את הדיוק.

הפרוטוקול הבא הוא מפורט ומאויר לבצע assay הגנת גנטמיצין שונה באמצעות כלים תרבות 96 היטב ושורת תאי RAW264.7 מקרופאג העכברית. בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי בכלי תרבות 24 גם, יש הפרוטוקול שונה את היתרונות הבאים: 1) שימוש בכלי תרבות 96 גם מאפשר עד 10 זנים מוטנטים שונים כדי להיות phenotyped כולל בקרות חיוביות ושליליות פנימיות עם עוצמה סטטיסטית מספקת;2) השונות של תוצאות מצטמצמת משמעותי, משום שהזנים מוטנטים נבדקים באותה צלחת התרבות ובו בזמן; 3) השימוש בטפטפות רבת ערוצים מגבירה את התפוקה תוך הפחתת עייפות מפעיל. לבסוף, בהשוואה לתרבות מנות 24 גם, חששות של תאי מארח פחות לכל גם בצלחת תרבות 96 היטב טופלו באמצעות אופטימיזציה פרוטוקול ותקינה.

לסיכום, assay שונה, הסטנדרטי במבחנת סלמונלה פנוטיפ או עמותת חיידקים אחרת, פלישה ושכפול בתאי phagocytic מגביר דיוק ומשיג יכולת תפוקה גבוהה תוך הפחתת עייפות מפעיל.

Protocol

תרבית תאים 1 Murine מקרופאג RAW264.7

1. לגדל תאי מקרופאג עכבריים מספר מעבר הנמוך, RAW264.7 (ATCC ^® מספר, TIB-71) בכובע T-75 תרבית תאי בקבוק פרק מסנן בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) , 0.5% ₃ NaHCO, ו -1% 100x חומצות חיוניות אמינו (NEAA) על 37 מעלות צלזיוס, ב5% CO ₂ באינקובטור.
2. ברגע שתאים מגיעים מפגש 60-80% בבקבוק, להשתמש מגרד תא למסוק תאים, ולספור את התאים בhemacytometer ולחשב את ריכוז התא.
3. Resuspend התאים ולדלל את ריכוז התא ל2.5 x 10 ⁵ / מ"ל במדיום תרבות תא טרי DMEM. השתמש בטפטפות רבות ערוצים לצלחת 200 μl של מדיום תרבות תא DMEM המכיל 5 x 10 ⁴ תאים בכל טוב של צלחות תרבית תאי 96 היטב.
4. פלייט ארבע בארות של כל זן סלמונלה. הגדר את שלוש צלחות נפרדות עבור קבוצה אחתשל assay פלישת תאי phagocytic, ולסמן אותם עם, "פלישה", "האגודה" ו "שכפול", בהתאמה.
5. מקם את הצלחות ב5% CO ₂ באינקובטור ב 37 ° C על מנת לאפשר את תאי מקרופאג לצרף לתחתית הבארות.

2 הכנת סלמונלה Wild-type ומוטאנטים

1. באותו היום של הכנת תאי RAW264.7 מקרופאג, לאסוף מושבות אחת של wild-type 14028s (WT) סלמונלה serotype enterica Typhimurium, מוטציה DinvA, מוטציה DphoP, וזנים מוטנטים מבחן הרצוי, ותרבותם לוריא-Bertani ( מרק LB) בתוספת אנטיביוטיקה על פי צורך. השתמש בכל סט של מבחני פלישת תאי phagocytic לבדוק עד 10 זנים מוטנטים (המוטציה DinvA ומוטצית DphoP פגומות בפלישה ושכפול תאיים, בהתאמה).
2. לגדל את החיידקים ל14 שעה על 37 מעלות צלזיוס עם יםhaking ב220 סל"ד ב 5 מ"ל כל אחת ממרק LB בפוליפרופילן 14 מ"ל הכתיר באופן רופף בצינור תחתון עגול. מרק LB מכיל אנטיביוטיקה מתאימה, במקרה שלנו, רוב הזנים מוטנטים עמידים לKanamycin, 50 מיקרוגרם / מ"ל
3. למחרת, תת כל אחד מON תרבויות של זני סלמונלה ב 5 מ"ל רגיל של מרקי LB ביחס של 1:50 ל4 שעות נוספות עם רעד ב220 סל"ד.
4. קראו OD ₆₀₀ ערכים של כל תרבות חיידקים בספקטרופוטומטר, וכל קריאה צריכה לנוע 0.6-1.2 כדי לייעל את מערכת פתוגניות סלמונלה האי-1 הסוג III הפרשה (TTSS SPI-1) ביטוי גנים לפלישה.
5. השתמש בנוסחא של OD 1 ₆₀₀ = 7.5 x 10 ⁸ CFU / מ"ל להעריך את ריכוז החיידקים, ואז לדלל חיידקים לריכוז של 5 x 10 ⁶ CFU / מ"ל במדיום תרבות תא טרי DMEM.

.3 הפלישה Assay בצלחת תרבות 96 היטב

1. הסר את שלושה cel 96 היטבצלחות תרבות l מן החממה CO ₂ ולשטוף היטב כל פעם עם 200 μl של חיץ 1x PBS.
2. לאחר כביסה וההסרה של PBS מלא, להוסיף 200 חיידקי μl במדיום DMEM (ראה לעיל) לכל אחד. התוצאה היא 1 x 10 ⁶ תאי סלמונלה בכל ריבוי טוב ושל זיהום (משרד הפנים) של 20: 1.
3. צנטריפוגה הצלחות XG ב 1000 במנשא אטום ל10 דקות, ולאחר מכן להחליף צלחות (זמן אפס) ב37 מעלות צלזיוס, חממה 5% CO ₂ למשך 30 דקות. עבור כל זן, להגדיר לפחות ארבע בארות כפולות.
4. לאחר 30 דקות, להסיר את הצלחות מן החממה ולשטוף שלוש פעמים עם 200 μl של 1x PBS להסיר חיידקי unassociated.
5. בעקבות כביסה, לשמור את הצלחת שכותרתו עם "עמותה" להמשך טיפול. הוסף 200 μl של מדיום DMEM המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין היטב בכל הצלחות מסומנות "פלישה" ו "שכפול" בt כדיo להרוג סלמונלה תאית. החזר את הצלחות ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור לשעה נוספת.
6. להציל את אחד גם מכל זן נגוע להקלטת ספירת תאי מקרופאג, טיפול בשאר בארות בצלחת "עמותה" עם 200 μl של 1x PBS המכיל 1% Triton X-100 עבור 10 דקות. פתרון טריטון יהיה lyse תאי מקרופאג ולשחרר סלמונלה קשורה.
7. הקציר סלמונלה מכל טוב ולהכניס אותם לתוך צינורות 1.5 מ"ל אפנדורף. בצע שלושה 10 דילולים סדרתי של פי עם 900μl 1x PBS על הדגימות שנקטפו מכל טוב, המערבולת מתבצעת בין כל דילול.
8. פלייט הדילול השלישי, 10 ^-3, משני צלחות LB (WT) או LB קאן (מוטציות). תווית הצלחות עם שם מתאים סלמונלה מתח, מספר דילול, נקודת זמן ותאריך.
9. לאחר vortexing צינור הדילול השלישי, לוותר מדגם 10 μl על פני השטח של אגר וf החוזרתפעמינו עבור הסכום כולל של 5 טיפות. הקפד חלל חמישה 10 μl טיפות באופן שווה על צלחות צלחת פטרי ^7.
10. לאחר הטיפות לספוג לתוך אגר, להפוך את הצלחות שוב ודגירת הלילה בשעה 37 מעלות צלזיוס, חממת 5% CO _2.
11. פנק את הבארות הצילו לספירה של מקרופאגים עם 150 1xPBS μl מכיל 0.25% טריפסין-EDTA עבור 10 דקות.
12. לאחר trypsinization, מקרופאגים מקום לתוך צינורות 1.5 מ"ל אפנדורף ולהתייחס אליהם ב50 μl של FBS לנטרל פתרון טריפסין / EDTA, להכתים את התאים עם 0.4% Trypan כחול ולהבקיע אותם דרך השימוש בhemacytometer.
13. כאשר הדגירה שעה אחת חלפה, להסיר את "הפלישה" וצלחות "שכפול" מחממת CO _2, ולשטוף היטב כל כ" שלב 3.4 ".
14. שמור את הצלחת "פלישה" להמשך טיפול בשם "שלב 3.6-3.12".
15. הוסף 200 μl של מדיום DMEM המכיל גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​להצלחת "שכפול" כדי לשמור על מרווח של סלמונלה תאית במדיום. להחזיר את הצלחת ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור ל22.5 שעות נוספות.
16. למחרת, להסיר את הצלחת "שכפול" מ37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור, ולשטוף היטב כל אחד בשם "שלב 3.4" ולהתייחס אליהם כ" שלב 3.6-3.12 ".
17. לבסוף, להסיר את הצלחות אגר לאחר הדגירה לילה ב37 ° C חממה ואת הציון את מספר מושבות חיידקים.
18. הפצת מושבה טובה צריכה להיות בין 10 ו100 מושבות, כל נקודה מכילה כ 2 עד 20 מושבות, שזה יהיה קשה להבקיע אם היו יותר מ 20 מושבות במקום אחד. אם הספירה היא נמוכה מדי או גבוהה מדי, replate המדגם עם פי 10 דילולים גבוהים יותר או נמוכים יותר בהתאם לצורך.

ניתוח .4 נתונים

1. לחשב (יחידות יצירת מושבות לכל מ"ל) CFU של כל צלחת המבוססת על הציפוינפח וגורם לדילול.
2. לברר את המספר של סלמונלה למקרופאג באמצעות ספירת תאי מקרופאג שנרשמה מכל זן.
3. לחשב את האמצעים הגיאומטריים של CFU למקרופאג מלפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים לעמותת תא, פלישה או שכפול, בהתאמה, ולנרמל נוסף לWT לערך היחסי.
4. לנתח את הנתונים לעמותה, פלישה, ושכפול על ידי -test t של סטודנט בהתאמה, על ידי השוואת כל זן לWT, ולקבוע את המובהקות הסטטיסטיות על ידי p-value.

תוצאות

ראה תוצאות נציג (איור 2) לאחר שהנתונים שהם זממו מבוססים על assay פלישת תאי phagocytic שונה. הנתונים כוללים חמישה זנים שונים, WT, ΔinvA, ΔphoP, מוטציה, וב 'שעבר מוטציה Δ invA, ידוע כפגום לפלישה, וΔphoP ידועים כפגום לשכפול ^8, המשמשים כביקורת חיובית כדי להעריך ...

Discussion

Assay ההגנה גנטמיצין הוא בשימוש נרחב כדי לחקור את הפלישה ושכפול של חיידקים פתוגנים תאיים בתוך תא מארח, וזה בעיקר כלי ביולוגי חשוב ללימוד פתוגנים, כמו סלמונלה, הפלישה שלו הוא צעד תנאי מוקדם להקמת זיהום ^1. Assay ההגנה גנטמיצין הסטנדרטי בקהילת מחקר סלמונלה מיו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965
Fetal bovine serum	HyClone	SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap	Nest Biotechnology	708003
100x Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140
Cell scraper	BD Falcon	353086
96-well Cell culture plate	Corning Incorporated	3595
Luria-Bertani (LB) broth	MP Biomedicals	3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube	BD Falcon	352059
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamycin solution	Sigma	K0254
Gentamicin solution	Sigma	G1272
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200
Trypan blue	Sigma	T8154