Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Zusammenfassung

Eine Hochdurchsatz-Assay in vitro Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen mit hoher Durchsatzleistung entwickelt. Die Methode wurde eingesetzt, um Salmonellen Gen-Knockout-Mutanten-Stämme für ihre Verstrickungen in der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten.

Zusammenfassung

Salmonella-Arten sind Zoonoseerreger und führenden Ursachen von lebensmittelbedingten Krankheiten bei Mensch und Vieh ^1. Das Verständnis der Mechanismen Salmonellen -host Interaktionen zugrunde liegen, sind wichtig, um die molekularen Pathogenese der Salmonellen-Infektion aufzuklären. Die Gentamicin-Schutztest auf Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen Phänotyp angepasst, damit Hochdurchsatz-Screening, um die Rollen der Deletionsmutanten von Salmonella enterica Serotyp Typhimurium in Wirt-Interaktionen mit RAW 264.7 Makrophagen Maus definieren. Unter diesem Protokoll, die Varianz bei Messungen, verglichen mit dem Standardprotokoll erheblich reduziert, da Wildtyp-und Mutantenstämmen mehrere in der gleichen Kulturschale und gleichzeitig getestet werden. Die Verwendung von Mehrkanalpipetten erhöht den Durchsatz und erhöht die Präzision. Darüber hinaus betrifft die Verwendung weniger ho bezogenenST-Zellen pro Well in 96-Well-Kulturschale angesprochen. Hier wurde das Protokoll des modifizierten in vitro-Assay mit Salmonella Invasion Fresszellen erfolgreich eingesetzt, um 38 Einzel Salmonellen Deletionsmutanten für Verein, Invasion und intrazellulären Replikationsphenotyp. Die in vitro-Phänotypen vorgestellt, von denen einige später bestätigt Phänotypen in vivo in einem Tiermodell zu haben. So wird die modifizierte, standardisierte Test mit Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Makrophagen, die mit Hochdurchsatzleistung konnte im weiteren Sinne verwendet, um Bakterien-Wirt-Interaktionen zu untersuchen Phänotyp.

Einleitung

Nontyphoidal Salmonellen sind wichtige Ursachen von Darmerkrankungen in allen Wirbeltieren. Salmonellose beim Menschen ist unter den Top bakterielle lebensmittelbedingten Erkrankungen ^ein. Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen von Salmonella mit ihrer tierischen Wirte unterstützen wird hauptsächlich durch die Untersuchung von Salmonella enterica-Serotyp typhimurium (STM) in der Gewebekultur und Tiermodellen der Infektion erreicht. Einblicke in STM-Wirt-Interaktionen wird uns helfen, zu verstehen, wie Salmonellen überleben und wachsen in Wirtszellen. Die erste Herausforderung bei der Untersuchung dieser Wechselwirkungen ist, so viele teilnehmende Faktoren wie möglich von beiden Wirt und Pathogen zu identifizieren, aber diese Bemühungen sind weitgehend durch den erheblichen Schwierigkeiten im Umgang mit zwei unabhängigen komplexen biologischen Systemen gleichzeitig, dh, Host-und Salmonella behindert, unter physiologischen Bedingungen. Zusätzlich ist die große repertOire von Salmonella und Wirtsgene möglicherweise Faktoren in Wirt-Interaktionen beteiligt Codierung erfordern Hochdurchsatz-biologische Plattform, um diese Herausforderung zu bewältigen.

Eine modifizierte, standardisierte Test mit Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Makrophagen, die mit Hochdurchsatzkapazität Phänotyp wurde entwickelt, um eine große Gruppe von Genen wahrscheinlich Beteiligung an Salmonellen -host Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Gentamicin-Schutz-Assay wurde im Jahr 1973 ² entwickelt, wurde aber zunächst gründlich von Elsinghorst 1994 ^3,4 beschrieben. Es wurde nun ein Standard-Werkzeug für die Untersuchung viele intrazelluläre bakterielle Erreger ex vivo, einschließlich Salmonellen ^5,6 geworden. Verinnerlicht Bakterien zu vermeiden, die von einigen Antibiotika, wie Gentamicin, die nicht eukaryotischen Zellen eindringen kann ³ getötet. Durch Ausnutzung dieses Phänomens, misst die Gentamicin-Schutz-Assay, das Überleben und das Wachstum von intrazellulären bacterial Krankheitserreger. Drei Ereignisse, die während der Infektion, das heißt zusammen mit eukaryotischen Zellen, Invasion und Replikation können für die intrazelluläre bakterielle Pathogene auf der Basis des Zeitintervalls zwischen der Infektion, Gentamicin-Behandlung und eine weitere Inkubation (1) ausgewertet werden. Eukaryotische Zelllinien eine physiologische Umgebung, die weniger komplex als relevanten Tiermodellen für Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien ist.

Die Gentamicin-Schutz-Assay ist eine geeignete Plattform, um STM-Wirt-Interaktionen zu studieren, aber die Standard-Assay in einer 24-Well-Kulturschale hat eine geringe Durchsatzkapazität. Computergestützte Analyse in vivo Datensätze identifiziert 149 Salmonella-Genprodukte, die voraussichtlich mit rund 300 Gast Genprodukte (unveröffentlichte Daten) zu interagieren. Die Standard-Gentamicin-Schutztest hat nicht die Fähigkeit, diese Anzahl von Mutanten effizient Phänotyp.

In additIonen, die Gentamicin-Schutz-Assay kann theoretisch die Invasion auch nur eines einzigen Bakterium erkennen. Wegen dieser inhärenten Empfindlichkeit sind die Rohdaten anfällig für technische Abweichungen, wenn zu verschiedenen Zeitpunkten wiederholt. Die internen Kontrollen und die relative Darstellung der Daten nach der Normalisierung sind für sinnvolle Interpretation der Ergebnisse. Angesichts dieser Überlegungen wurde eine modifizierte, standardisierte Gentamicin Protection Assay entwickelt, um Testkapazität erhöhen und die Präzision.

Das folgende Protokoll ist eine detaillierte und illustrierte, um die geänderte Gentamicin-Schutz-Assay unter Verwendung von 96-Well-Kulturschalen und die murine Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 durchzuführen. Im Vergleich zur Standard-Protokoll in 24-Well-Kulturschalen hat die modifizierte Protokoll die folgenden Vorteile: 1) unter Verwendung von 96-Well-Kulturschalen können bis zu 10 verschiedene Mutantenstämme phänotypisiert werden einschließlich der internen positiven und negativen Kontrollen mit ausreichender statistischer Power;2) Die Varianz der Ergebnisse wird deutlich reduziert, da die Mutantenstämme sind in der gleichen Kulturschale und zur gleichen Zeit getestet; 3) Die Verwendung von Mehrkanalpipetten erhöht den Durchsatz und reduziert Ermüdungserscheinungen. Schließlich Vergleich zu 24-Well-Kulturschalen wurden Bedenken von weniger Wirtszellen pro Well in 96-Well-Kulturschale durch Protokolloptimierung und Standardisierung gerichtet.

Zusammenfassend ist die modifizierte, standardisierte Test zur in-vitro-Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen erhöht die Präzision und erreicht Hochdurchsatzleistung bei gleichzeitiger Reduzierung Ermüdung des Bedieners.

Protokoll

1. Murine Makrophagen RAW264.7 Zellkultur

1. Wachsen niedrige Durchgang Nummer murine Makrophagen, RAW264.7 (ATCC ^® Nummer, TIB-71) in einem T-75 Zellkulturflasche abgelassen Filterkappe in Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 0,5% NaHCO ₃ und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren 100x (NEAA) bei 37 ° C in einem 5% CO _2-Inkubator.
2. Sobald Zellen erreichen eine 60-80% Konfluenz in den Kolben, mit einem Zellschaber, um Zellen zu ernten, und zählen Sie die Zellen in einer Hämazytometer und berechnen die Zellkonzentration.
3. Die Zellen und die Zellkonzentration verdünnt in 2,5 x 10 ⁵ / ml in frischem DMEM-Zellkulturmedium. Mehrkanalpipetten verwenden, um 200 ul DMEM-Zellkulturmedium, enthaltend 5 × 10 ⁴ Zellen in jeder Vertiefung der 96-Well-Zellkulturplatten zu plattieren.
4. Platte vier Vertiefungen jeder Salmonella Stamm. Drei getrennte Platten für einen Satz gesetztvon Fresszellen Invasion Assay, und markieren Sie diese mit "Verein", "Invasion" und "Replikation" auf.
5. Platzieren der Platten in 5% CO ₂ Inkubator bei 37 ° C auf, damit die Makrophagen-Zellen auf den Boden der Vertiefungen anzubringen.

2. Herstellung von Salmonellen Wildtyp-und Mutanten

1. Am selben Tag der Aufstellung des Makrophagen RAW264.7 Zellen, nehmen einzelne Kolonien von Wildtyp (WT) Salmonella enterica Serotyp Typhimurium 14028s, DinvA Mutante DphoP Mutante und die gewünschten Test-Mutantenstämme, und Kultur sie in Luria Bertani-( LB) Brühe mit Antibiotika und gegebenenfalls ergänzt. Verwenden jedes Satzes der Phagozyten Invasionsassays zu testen bis 10 Mutantenstämme (DinvA mutierten und mutierten DphoP sind Invasion und intrazelluläre Replikation defekt, beziehungsweise).
2. Wachsen die Bakterien für 14 Stunden bei 37 ° C mit sHAKING bei 220 rpm in LB-Medium je 5 ml in 14 ml lose verschlossen Polypropylen in einer Röhre mit rundem Boden. LB-Medium enthält geeigneten Antibiotika, in unserem Fall sind die meisten der Mutanten-Stämme resistent gegen Kanamycin, 50 ug / ml
3. Am nächsten Tag, Subkultur jeder der EIN-Kulturen von Salmonella-Stämmen in Klar 5 ml LB-Brühe in einem Verhältnis von 1:50 für weitere 4 h unter Schütteln bei 220 UpM.
4. Lesen OD _600-Werte jedes Bakterienkultur auf einem Spektrophotometer, und jede Lese sollte 0,6 bis 1,2 reichen, um Salmonellen Pathogenität Insel-1-Typ-III-Sekretionssystem (SPI-1 TTSS) Genexpression für die Invasion zu optimieren.
5. Verwenden der Formel von 1 OD ₆₀₀ = 7,5 x 10 ⁸ CFU / ml, um die Bakterienkonzentration zu schätzen, dann verdünnte Bakterien in einer Konzentration von 5 x 10 ⁶ KBE / ml in frischem DMEM-Zellkulturmedium.

3. Invasion Assay in 96-Well-Kulturplatte

1. Entfernen Sie die drei 96-Loch-cell Kulturplatten aus dem CO _2-Inkubator und waschen jeweils auch einmal mit 200 ul 1x PBS-Puffer.
2. Nach dem Waschen und vollständige Entfernung von PBS, 200 ul Bakterien in DMEM-Medium (siehe oben) in jedes Well. Dies führt zu 1 x 10 ⁶ Salmonella-Zellen in jede Vertiefung und Multiplizität der Infektion (MOI) von 20: 1 beträgt.
3. Zentrifugieren der Platten bei 1000 × g in einem verschlossenen Träger für 10 min, dann ersetzen Platten (Zeit Null) in einem 37 ° C, 5% CO ₂ Inkubator für 30 min. Für jeden Stamm, richtet mindestens vier zwei Vertiefungen.
4. Nach 30 Minuten, entfernen Sie Platten aus dem Inkubator und dreimal mit 200 ul 1x PBS auf unassociated Bakterien zu entfernen.
5. Nach dem Waschen, speichern Sie die Platte mit "Verein" für die weitere Behandlung gekennzeichnet. Fügen Sie 200 ul DMEM-Medium mit 100 ug / ml Gentamicin in jede Vertiefung der mit "Invasion" und "Replikation" markiert Platten, um to töten die extrazelluläre Salmonellen. Bringen Sie die Platten bis 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator für eine zusätzliche Stunde.
6. Zu retten und von jedem infizierten Belastung für die Aufzeichnung von Makrophagen-Zellzahl, behandeln den Rest der Brunnen auf dem "Verein" Platte mit 200 ul 1x PBS mit 1% Triton X-100 für 10 min. Die Triton-Lösung Makrophagenzellen lysieren und damit verbundenen Salmonellen.
7. Ernte Salmonellen aus jeder Vertiefung und legen Sie sie in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Führen Sie drei 10-fach serielle Verdünnungen mit 900μl 1x PBS auf den geernteten Proben aus jeder Vertiefung wird Wirbel zwischen jeder Verdünnung durchgeführt.
8. Platte der dritten Verdünnung, 10 ^-3, entweder auf LB (WT) oder LB-Kan (Mutanten)-Platten. Beschriften Sie die Platten mit entsprechenden Salmonella Stamm Name, Verdünnungszahl, Zeitpunkt und Datum.
9. Nach Vortexen des dritten Verdünnungsröhrchen, verzichten 10 ul Probe auf der Oberfläche des Agars und Wiederholen funserer Zeit für insgesamt 5 Tropfen. Achten Sie darauf, den Raum der fünf 10 ul Tropfen gleichmäßig auf die Petrischale Platten ^7.
10. Nach den Tropfen in den Agar einweichen, drehen die Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator.
11. Gönnen Brunnen für die Zählung von Makrophagen mit 150 ul 1xPBS mit 0,25% Trypsin-EDTA für 10 min gespeichert.
12. Nach Trypsinierung, Ort Makrophagen in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und behandeln sie mit 50 ul FBS zu Trypsin / EDTA-Lösung zu neutralisieren, färben die Zellen mit 0,4% Trypanblau und Gäste sie unter Anwendung Hämazytometer.
13. Wenn die eine Stunde Inkubation abgelaufen ist, entfernen Sie die "Invasion" und "Replikation" Platten aus dem CO _2-Inkubator, und waschen jedes sowie "Step 3.4".
14. Speichern Sie die "Invasion" Platte für die weitere Behandlung als "Schritt 3,6-3,12".
15. Gib 200 ul DMEM-Medium mit 10 ug / ml Gentamicindie "Replikation" Platte Abstand von extrazellulären Salmonellen in dem Medium zu erhalten. Bringen Sie die Platte auf 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator für eine zusätzliche 22,5 Stunden.
16. Am nächsten Tag nehmen Sie die "Replikation" Platte von 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator, und waschen jedes sowie "Step 3.4" und behandeln sie als "Schritt 3,6-3,12".
17. Schließlich entfernen Sie die Agar-Platten nach der Inkubation über Nacht im 37 ° C Inkubator und Gäste die Anzahl der Bakterienkolonien.
18. Eine gute Verteilung Kolonie sollte zwischen 10 und 100 Kolonien, enthält jede Stelle etwa 2 bis 20 Kolonien, wäre es schwer zu punkten, wenn es mehr als 20 Kolonien auf einem Fleck. Wenn die Zählung zu niedrig oder zu hoch ist, Ausstrich der Probe mit 10-fach höhere oder niedrigere Verdünnungen nach Bedarf.

4. Datenanalyse

1. Berechnen Sie die KBE (Koloniebildung Einheiten pro ml) jeder Platte auf der Basis der BeschichtungVolumen und Verdünnungsfaktor.
2. Ermitteln Sie die Anzahl der Salmonellen pro Makrophagen durch die Makrophagen aufgenommen Zellzahl von jedem Stamm.
3. Berechnen Sie die geometrischen Mittel der KBE pro Makrophagen aus mindestens drei unabhängigen Experimenten für die Zellverband, Invasion oder Replikation bzw. normalisieren und weiter nach WT für den relativen Wert.
4. Analysieren Sie die Daten für die Assoziation, Invasion und Replikation von Student-t-test bzw. indem jeder Stamm WT, und bestimmen Sie die statistische Signifikanz von p-Wert.

Ergebnisse

Siehe repräsentative Ergebnisse (Figur 2), nachdem die Daten auf der Basis des modifizierten phagozytischen Zellinvasionstest aufgetragen. Die Daten sind fünf verschiedene Stämme, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutierten A, B und Mutanten Δ InvG bekannt für die Invasion defekt zu sein, und ΔphoP bekannt für die Replikation ⁸ defekt zu sein, werden als positive Kontrollen verwendet werden, um die experimentelle Gültigkeit zu überprüfen . In der Tat, in der modifiziert...

Diskussion

Die Gentamicin-Schutztest wird häufig eingesetzt, um das Eindringen und die Vermehrung von intrazellulären bakteriellen Krankheitserregern im Wirtszelle zu untersuchen, und es ist insbesondere ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung biologischer Pathogene wie Salmonellen, deren Einfall ist die Voraussetzung für die Festlegung Schritt ¹ Infektion. Die Standard-Gentamicin-Schutztest bei Salmonella-Forschung wird in 24-Well-Kulturschale ⁵ implementiert. Obwohl die Verwendung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965
Fetal bovine serum	HyClone	SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap	Nest Biotechnology	708003
100x Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140
Cell scraper	BD Falcon	353086
96-well Cell culture plate	Corning Incorporated	3595
Luria-Bertani (LB) broth	MP Biomedicals	3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube	BD Falcon	352059
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamycin solution	Sigma	K0254
Gentamicin solution	Sigma	G1272
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200
Trypan blue	Sigma	T8154