تقييم القدرة الإفرازية للخلايا البنكرياس عنيبية

Summary

عنيبات ​​البنكرياس معزولة تحتفظ في الجسم الحي على التشكل والنشاط وتوفر وسائل قوية لرصد والتلاعب إفراز. يوضح هذا العمل كيف عنيبات ​​يمكن عزل من البنكرياس الماوس، وكيف يمكن تقييم قدراتها الإفرازية.

Abstract

عنيبية خلايا البنكرياس تنتج وتفرز الإنزيمات الهضمية. ويتم تنظيم هذه الخلايا باعتبارها الكتلة التي تشكل وأسهم التجويف المشترك. يوضح هذا العمل كيف أن قدرة إفرازية من هذه الخلايا يمكن تقييمها من قبل ثقافة عنيبات ​​معزولة. الإعداد هو مفيد منذ عنيبات ​​معزولة، التي تحتفظ بخصائص كثيرة من إفرازات البنكرياس سليمة يمكن التلاعب بها ومراقبتها بسهولة أكثر في الحيوان كله. العزلة السليمة للعنيبات ​​البنكرياس هو شرط أساسي بحيث ثقافة فيفو السابقين سوف تمثل الطبيعة في الجسم الحي من عنيبات. يوضح البروتوكول كيفية عزل عنيبات ​​سليمة من البنكرياس الماوس. بعد ذلك، يتم عرض طريقتين التكميلية لتقييم إفراز البنكرياس. يقدم فحص إفراز الأميليز كإجراء العالمي، بينما التصوير المباشر لإفراز البنكرياس يسمح توصيف إفراز في قرار شبه الخلوية. بشكل جماعي، وتقنيات حاضراتيد هنا تمكين طائفة واسعة من التجارب لدراسة إفراز خارجية الإفراز.

Introduction

إفرازات البنكرياس يشكل أكثر من كتلة البنكرياس الثدييات و هو مخصص لإنتاج وإفراز الإنزيمات الهضمية ^1. الوحدة الوظيفية للإفرازات البنكرياس، وعنيبة، هي مجموعة من الخلايا الظهارية التي تشكل وأسهم التجويف المشترك. على التحفيز الهرموني أو العصبية، ويتم نقل حويصلات مليئة الانزيمات لسطح الخلية قمي، فتيل معها وطرد محتوياتها في تجويف ^1-3. ثم يتم استنزاف الإنزيمات التي يفرزها مجموعة تلاحم القنوات إلى الأمعاء الدقيقة، حيث حفز انهيار المواد الغذائية إلى المواد المغذية.

يوضح هذا الفيديو كيفية عنيبات ​​سليمة يتم عزل من البنكرياس كله، وكيف يمكن تقييم قدرتها الإفرازية. باستخدام هذا الإعداد، يتم إفراز البنكرياس كميا عن طريق قياس كمية النسبي للالأميليز الذي تم إصداره بعد التحفيز. بدلا من ذلك، يمكن إفراز تصوير العيش من خلال استخدام مختلفأجهزة الاستشعار والأصباغ.

الإعداد فيفو السابقين من عنيبات ​​البنكرياس هو مفيد منذ عنيبات ​​معزولة، التي تحتفظ بخصائص كثيرة من البنكرياس سليمة، يمكن التلاعب بها ومراقبتها بسهولة أكثر في الحيوان كله ^4-6. وقد تم تطوير هذا الإعداد في الأصل في أواخر عام 1970 وكان منذ تمديدها لدراسة عدة أنسجة خارجية الإفراز مثل اللعابية والغدد الثديية ^3-7. والجدير بالذكر، أنه يسمح للدراسة إفراز مع أقل تدخل ممكن للمنظمات الخلوية المعقدة لهذه الظهارة الاستقطاب.

Protocol

ملاحظة: الإجراءات التي تجرى على الحيوانات وقد تمت الموافقة من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في معهد وايزمان للعلوم.

إعداد 1. عينة

1. عزل عنيبات ​​البنكرياس
   1. إعداد 300 مل من الطازجة بيكربونات كريبس-قارع الأجراس HEPES (KRBH) متوسطة قبل البدء. مزيج كلوريد الصوديوم 140 ملم، 4.7 ملم بوكل، 1.16 ملم MgCl _2، 1 مم CaCl ₂ و 11 ملي الجلوكوز، 10 ملي HEPES. إضافة ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.1 ملغ / مل مثبط التربسين فول الصويا (STI) (إعادة تعليق المتوسطة). إعداد 5-10 مل من إعادة تعليق تستكمل المتوسطة مع كولاجيناز (~ 0.75 ملغ / مل) (وسط الهضم).
   2. الأوكسجين المتوسط ​​KRB ل~ 30 دقيقة. إضافة BSA بعد الأوكسجين لمنع محتدما. إعادة تعليق الهضم وجلب وسائل إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: بالاكسجين المتوسط ​​يقلل وفيات الخلية ويحسن القدرة على الاستجابة للsecretagogues. تأثير الأوكسجين هو ظاهر على الأقل لمدة 6 ساعة.
   تضحية الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم أو CO ₂ الخنق، وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان المؤسسية. وضع الحيوان ضحى على ظهرها، ونعلق عليه إلى لوحة تشريح وتنظيف السطح البطني مع الايثانول.
   ملاحظة: من أجل تجنب التلوث، الأوتوكلاف أدوات تشريح والمياه المستخدمة في KRBH المتوسطة قبل الاستخدام. تصفية KRBH المتوسطة من خلال مرشح 0.2 ميكرون. قبل استئصال البنكرياس شطف الأدوات تشريح مع الايثانول 70٪ وإجراء تشريح على مقاعد البدلاء النظيفة. تنفيذ العدوى الفيروسية في مستوى 3 مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إضافة المضادات الحيوية إلى O / N زراعة المتوسطة (انظر القسم 4).
2. استئصال البنكرياس الفئران
   1. على نطاق واسع شق الجلد في البطن وطبقة تحت الجلد. التعرف على الكبد والمعدة والأمعاء والبنكرياس والطحال (الشكل 1). ملاحظة: في الخطوات التالية، والتعامل مع أنسجة البنكرياس بلطف وتجنب تطبيق forc الميكانيكية المفرطه لمنع السيارات الهضم وفاة الأنسجة والخلايا.
   2. باستخدام اثنين ملقط حادة، سحب الأمعاء الدقيقة. تبدأ في نهاية الأمعاء الدقيقة القريبة، بالقرب من الخروج من المعدة. فصل البنكرياس من الأمعاء والاحتفاظ بها داخل تجويف الجسم. وبمجرد الوصول إلى الأمعاء الغليظة، لاحظ أ / النسيج الضام بيضاء وردية اللون. لا تخلط بين ذلك مع البنكرياس.
   3. مسح قدر الأنسجة البنكرياس ممكن من دون جمع الأنسجة الدهنية أو الضامة. إزالة البنكرياس من قبل فصلها من الطحال والمعدة وقطع الأوعية الدموية في البطن تحته (الشكل 1A-C).
      ملاحظة: بما أن العائد من عنيبات ​​البنكرياس من حيوان واحد مرتفع، ويمكن للمرء أن الامتناع عن جمع كل أنسجة البنكرياس من أجل منع جمع الأنسجة الأخرى.
3. كولاجيناز الهضم
   1. شطف البنكرياس عدة مرات في إعادة تعليق المتوسطة تسخينها إلى 37 درجة مئوية وإزالة الأجزاء المتبقية من غير البنكرياسالأنسجة. تزج البنكرياس في ~ 5 مل من قبل ساخنة المتوسطة الهضم في 20 مل قارورة التلألؤ. تخطر على البنكرياس لقطعة من 1-3mm. وضعه في حمام الماء الساخن (الأمثل في إطار التحريض من ~ 100 دورة في الدقيقة). لتسريع الهضم، ماصة صعودا وهبوطا الأنسجة هضمها مرة واحدة كل بضع دقائق.
      ملاحظة: مدة كولاجيناز الهضم تعتمد بشكل رئيسي على تركيز كولاجيناز وعلى مقدار القوة الميكانيكية المطبقة على الأنسجة. استخدام 0.75 ملغ / مل كولاجيناز لحوالي 15 دقيقة وpipetting لالأنسجة مع ماصة 5 مل البوليسترين مع 2 مم فوهة كل 3-5 دقيقة، مما أدى إلى عنيبات ​​من 10-30 الخلايا. بعد الهضم، وتعليق يبدو العكرة التي تحتوي على قطع مرئية من الأنسجة. منذ collagenases الكفاءة تختلف بين أنواع مختلفة تجارية والكثير، وتحديد توقيت الهضم تجريبيا.
   2. الغسيل والترشيح
      1. نقل الأنسجة هضمها في أنبوب 50 مل وإنهاء حفرestion بإضافة 45 مل من إعادة تعليق المتوسطة. تصفية تعليق من خلال الخشنة (~ 1 ملم) شبكة معدنية إلى أنبوب جديد. أجهزة الطرد المركزي من خلال تدفق في 100 × ز لمدة 3 دقائق.
      2. تجاهل طاف ومعلق البنكرياس هضمها في 50 مل من إعادة تعليق المتوسطة. تصفية تعليق من خلال 70 أو 100 ميكرومتر شبكة النايلون. الطرد المركزي كما كان من قبل.
      3. من أجل إزالة العائمة، عنيبات ​​التالفة، تجاهل طاف و resuspend الأنسجة في البنكرياس 3-5 مل من إعادة تعليق المتوسطة. تطبيق 1 مل أجزاء من عنيبات ​​البنكرياس إلى 15 مل أنابيب مخروطية مليئة 7 مل من إعادة تعليق المتوسطة. السماح للعنيبات ​​ليستقر عن 2 - 3 دقيقة. جمع عنيبات ​​التي استقرت في قاع الأنبوب مع ماصة 1 مل، وتكرار هذه الخطوة 2 - 3 مرات.
      4. عرض عنيبات ​​البنكرياس تحت المجهر الخفيفة أو تشريح لاختبار حالتهم. في الشكل 2، ومراقبة نقاوة العزلة والأضرار التي لحقت الخلايا الدورينانوغرام العزلة. استخدام هذه عنيبات ​​فورا أو الثقافة لمدة تصل إلى 20 ساعة.

2. الأميليز إفراز الفحص

ملاحظة: يقدم فحص إفراز الأميليز كمقياس عالمي لقدرة إفرازية من عنيبات ​​البنكرياس. ويتحقق ذلك من خلال جمع المتوسطة التي حضنت عنيبات ​​البنكرياس، وتحديد النشاط الأميليز من المتوسط، عادة باستخدام عدة التجارية.

1. تحديد عدد من الشروط التجريبية ليتم فحص (مقابل مثل غير حفز حفز). استخدام لا يقل عن ثلاثة مكررات لكل حالة. بالإضافة إلى ذلك، إضافة مجموعة من مكررات لتحديد المحتوى الكلي الخلوي الأميليز ('مجموع' عينة) ومجموعة للنشاط الأميليز من المتوسط ​​(عينة "الصفر"). تسمية لوحة متعددة جيدا التي ستجرى الفحص، ومجموعتين من microtubes لكل من مكررات لاستخدامها.
   ملاحظة: 12- أو 24 لوحة جيداق يمكن استخدامها لرصد 1 و 0.5 مل من تعليق عنيبية، على التوالي.
2. غسل عنيبات ​​مرتين في 30 مل من إعادة تعليق KRBH المتوسطة واحتضان لهم في إعادة تعليق متوسطة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لوحة متعددة جيدا إضافة قطرة 10μl من افراز للوصول إلى التركيز النهائي المناسب.
3. عنيبات ​​البنكرياس تستجيب إلى التدرج من افراز بطريقة ثنائية طوري. تركيزات مع القيم المثلى هي إفراز 50-100 من مساء كوليسيستوكينين (CCK) و1μM من كرباكول (الشكل 3A) ^5.
4. غسل و resuspend عنيبات ​​في إعادة تعليق المتوسطة. تأكد من أن عنيبات ​​توزع متجانس في تعليق وقسامة كميات متساوية من تعليق في لوحة متعددة جيدا والى "microtubes المسمى total'. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. (يفضل أن يكون في حمام مائي في إطار التحريض معتدل (~ 50 دورة في الدقيقة)).
   ملاحظة: العدد الدقيق للعنيبات ​​قد تختلف بين التجربهTS لكن يجب ان يكون مماثلا في مكررات في كل تجربة. وبالتالي، aliquoting الدقيق للتعليق عنيبات ​​أمر بالغ الأهمية لمقارنة بين مكررات وظروف مختلفة.
5. أثناء الحضانة، وإنتاج "الكل" والعينات "الصفر". أجهزة الطرد المركزي في "المجموع" microtubes لبضع ثوان في 5،000 × ز وإزالة 50 ميكرولتر من طاف في "microtubes zero' المسمى ووضعها في 4 درجات مئوية. ليز عنيبات ​​في "المجموع" عينات بإضافة تريتون X-100 إلى microtubes للوصول إلى تركيز النهائي من 1٪. دوامة microtubes بقوة.
   ملاحظة: Aliquote في "المجموع" يتطابق مماثل لمكررات التجربة. Lysing وعنيبات، يؤدي إلى الإفراج عن المحتوى الكلي الأميليز. بدلا من ذلك، جمع عنيبات ​​في كل حالة وليز في نهاية التجربة، لتحديد محتوى الخلوي للكل تكرار.
6. جمع معظم عنيبية تعليق طn لأول مجموعة من microtubes صفت مسبقا. الطرد المركزي microtubes لبضع ثوان في 5،000 × ز. نقل طاف في المجموعة الثانية من microtubes صفت مسبقا.
7. مقايسة طاف للنشاط الأميليز مع مجموعة تجارية. حساب النسبة المئوية من يفرز الأميليز.
   ملاحظة: من المهم جدا لقراءة النشاط الأميليز في مجموعة خطية لها. تقديم نسبة الأميليز يفرز مثل الأميليز في المئة من المفرج عنهم من المحتوى الأولي الكلي. طرح مستوى الأميليز خلفية المتوسطة من كل ثلاث نسخ ونقسمه على المحتوى الكلي الأولي تطبيع بالمثل.

3. تصوير لايف من إفراز البنكرياس

إفراز من عنيبات ​​البنكرياس يمكن رصدها مباشرة بواسطة التصوير الحي. باستخدام مختلف الأصباغ الفلورية وأجهزة الاستشعار، والتصوير الحي يسمح توصيف إفراز في قرار شبه الخلوية.

1. إعداد المؤكسج حديثا المتوسطة إعادة تعليق وكما قلتن خطوة 1.1 وإحضاره إلى 37 درجة مئوية. تعيين المجهر، وإذا مجهزة تحكم في درجة الحرارة، وضبط إلى 37 درجة مئوية.
2. غسل الخلايا عنيبية في 30 مل من إعادة تعليق متوسطة ووضعها في كوب أو البلاستيك الشريحة. ملاحظة: إذا الأصباغ محبة للدهون سوف تستخدم لتسمية لغشاء البلازما المسمى مع الأصباغ محبة للدهون، وصمة عار على عنيبات ​​مدة لا تزيد عن 5 دقائق لمنع وضع العلامات الأغشية الداخلية من خلال الإلتقام. في جميع أنحاء العمل، والتعامل مع عنيبات ​​بلطف وتجنب pipetting لالمفرط.
3. مرة واحدة على المجهر، صورة عنيبات ​​التي التشكل هو واضح، وتجنب التصوير من عنيبات ​​التي تعرض الفقاعات basolateral أو فجوات داخل الخلايا. إضافة قطرة افراز الحكمة أو باستخدام غرفة التروية، إما أثناء أو مباشرة قبل بدء التصوير.
   ملاحظة: عدسات التكبير عالية مع فتحات رقمية عالية (مثل × 63 / 1.4 × 100 أو / 1.4) ويوصى لمراقبة الهياكل التحت خلوية.

4. O / N ثقافة البنكرياس عنيبات ​​(خلية البديل ثقافة وتقنيات)

ملاحظة: O / N غالبا ما تستخدم لزراعة عدوى فيروس الغدة. تتم الإصابة بها في 10 -10 ^{6 7} PFU / مل ل9 - 16 ساعة قبل الفحص.

1. ثقافة عنيبات ​​البنكرياس لمدة تصل إلى 20 ساعة. عنيبات ​​معلق تم الحصول عليها من البنكرياس واحدة في 25 مل مستنبت (DMEM تستكمل مع مصل العجل الجنين (FCS) (5٪)، الصوديوم البيروفات (1٪)، والمضادات الحيوية (1٪)، L-الجلوتامين (0.5٪)، BSA (10 ملغ / مل) والأمراض المنقولة جنسيا (0.2 ملغ / مل)، وتنقسم إلى خمس لوحات 10CM. تصيب عنيبات ​​مع الفيروس في مستوى 3 مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
2. حضنت عنيبات ​​البنكرياس في 37ºC في 5٪ CO ₂ ترطيب الهواء. تسمح عنيبات ​​لاسترداد في المؤكسج المتوسطة إعادة تعليق لمدة 30 دقيقة قبل الفحص اللاحق ^3،8.

النتائج

عنيبات ​​البنكرياس التي تم عزلها بشكل صحيح عرض مورفولوجيا النمطية عندما ينظر اليها من الضوء المرسل. يجب أن تظهر المجالات basolateral من جولة وخال من الفقاعات. ويحيط المجال قمية من قبل مئات من الحويصلات الإفرازية ويبدو أكثر قتامة في اللون (الشكل 2A، B). وتقع النواة ...

Discussion

إلى جانب الثقافة فيفو السابقين، الاجهزة البديلة لدراسة إفراز خارجية الإفراز وتشمل intravital المجهري وقياس السوائل من القناة البنكرياسية. وقد تبين intravital المجهري للعمل بشكل جيد في الماوس الغدد اللعابية ^10. هذه الطريقة يمكن تسجيل إفراز في الوقت الحقيقي في الحيو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808