הערכת יכולת ההפרשה של תאי הלבלב Acinar

Summary

acini לבלב המבודד לשמור המורפולוגיה שלהם in vivo ופעילות ומציע דרכים רבות עוצמה לניטור וטיפול הפרשה. עבודה זו מדגימה כיצד ניתן לבודד acini מלבלב העכבר, וכיצד ניתן להעריך את יכולות ההפרשה שלהם.

Abstract

תאי acinar לבלב לייצר ולהפריש אנזימי עיכול. תאים אלה מאורגנים כצביר אשר מהווה ומניות לומן משותף. עבודה זו מדגימה כיצד יכולת ההפרשה של תאים אלה יכול להיות מוערכת על ידי התרבות של acini המבודד. ההתקנה היא יתרון שכן acini המבודד, אשר שומר על מאפיינים רבים של לבלב אקסוקרינית שלם ניתן להשפיע ופיקוח בקלות רבה יותר מאשר בכל בעלי החיים. בידוד נכון של acini הלבלב הוא דרישת מפתח, כך שהתרבות vivo לשעבר תייצג את הטבע בvivo של acini. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד acini שלם מהלבלב של העכבר. בהמשך לכך, בשתי שיטות משלימות להערכת הפרשת לבלב מוצגות. Assay הפרשת עמילאז משמש כמדד גלובלי, תוך הדמיה ישירה של הפרשת לבלב מאפשרת האפיון של הפרשה ברזולוציה משנה הסלולר. באופן קולקטיבי, טכניקות presenטד כאן מאפשר קשת רחבה של ניסויים כדי ללמוד הפרשת אקסוקרינית.

Introduction

לבלב אקסוקרינית מהווה רוב המסה של הלבלב של היונקים והוא ייעודי לייצור והפרשה של אנזימי עיכול ^1. היחידה התפקודית של לבלב אקסוקרינית, acinus, היא מקבץ של תאי האפיתל המהווה ומניות לומן משותף. על גירוי הורמונלי או עצבי, שלפוחית ​​מלאה באנזימים מועברות לתא שטח הפסגה, נתיך איתו ולגרש את התוכן שלהם לתוך לומן ^1-3. אז האנזימים המופרשים מרוקנים על ידי קבוצה התגבשה של צינוריות למעי דק, שבו הם מאיצים את השבירה של מזון לחומרים מזינים.

וידאו זה מדגים כיצד שלם acini מבודדים מכל הלבלב וכיצד ניתן להעריך את יכולת ההפרשה שלהם. באמצעות התקנה זו, הפרשת לבלב היא לכמת על ידי מדידת הכמות היחסית של עמילאז ששוחרר בעקבות גירוי. לחלופין, הפרשה ניתן הדמיה חי על ידי השימוש בשונהחיישנים וצבעים.

התקנת vivo לשעבר של acini הלבלב היא יתרון שכן acini המבודד, אשר שומר על מאפיינים רבים של הלבלב שלם, ניתן להשפיע ופיקוח בקלות רבה יותר מאשר בכל בעלי החיים ^4-6. התקנה זו פותחה במקור בסוף שנת 1970 והייתה מאז להארכה למחקר של כמה רקמות אקסוקרינית כגון הרוק ובלוטות החלב ^3-7. יש לציין, שהוא מאפשר לימוד ההפרשה עם הפרעה מינימאלית לארגונים הסלולריים המורכבים האפיתלים מקוטבים אלה.

Protocol

הערה: נהלים מעורבים נושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) במכון ויצמן למדע.

הכנת .1 לדוגמא

1. בידוד של acini הלבלב
   1. הכן 300 מ"ל של HEPES בינוניים ביקרבונט קרבס-Ringer הטרי (KRBH) לפני שמתחיל. מערבבים 140 mM NaCl, 4.7 מ"מ KCl, 1.16 מ"מ MgCl _2, 1 מ"מ CaCl _2, 11 מ"מ גלוקוז, 10 HEPES מ"מ. הוספת אלבומין בסרום שור (BSA) ומעכב 0.1 מ"ג / מ"ל ​​טריפסין הסויה (STI) (בינוני resuspension). הכן 5 - 10 מ"ל של resuspension בינוני בתוספת Collagenase (~ 0.75 מ"ג / מ"ל) (בינוני עיכול).
   2. חמצן בינוני KRB ל~ 30 דקות. הוספת BSA אחרי חמצון כדי למנוע מבעבע. להביא מדיומים resuspension ועיכול ל37 C °. הערה: החמצון הבינוני מפחית את תמותת תאים ומשפר את ההיענות לsecretagogues. ההשפעה של חמצון היא לכאורה לפחות למשך 6 שעות.
   3. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם או CO ₂ מחנק, על פי הנחיות טיפול בבעלי החיים מוסדיות. מניחים את החיה הקריבה על הגב שלה, לצרף אותו לכרית לנתיחה ולנקות את משטח הבטן עם אתנול.
      הערה: על מנת למנוע זיהום, חיטוי הכלים לנתיחה ומים המשמשים למדיום KRBH לפני השימוש. סנן בינוני KRBH דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. לפני הכריתה של הלבלב לשטוף הכלים נתיחה עם 70% אתנול ולבצע נתיחה על ספסל נקי. לבצע זיהומים נגיפיים בקבינט ביו בטיחות ברמת 3. הוספת אנטיביוטיקה לO / הבינוני culturing N (ראה סעיף 4).
2. כריתת הלבלב העכברי
   1. חתך נרחב עור בטן ושכבה התת עורית. זהה את הכבד, קיבה, מעי, הלבלב וטחול (איור 1). הערה: בשלבים הבאים, לטפל ברקמת הלבלב בעדינות ולהימנע מהחלת forc המכני מוגזםדואר כדי למנוע אוטומטי עיכול של מות הרקמות ותאים.
   2. על ידי שימוש בשני מלקחיים בוטים, לשלוף את המעי הדק. התחל מהקצה הפרוקסימלי המעי הדק, בסמוך ליציאה מהבטן. הפרד את הלבלב מהמעי ולשמור אותו בתוך חלל הגוף. ברגע שמגיע למעי גס, שם לב רקמה ורוד / לבן חיבור. אל תבלבל אותו עם הלבלב.
   3. לנקות כמה שיותר רקמת לבלב ככל האפשר מבלי איסוף רקמת שומן או חיבור. הסר את הלבלב על ידי ניתוקו מהטחול והקיבה וחיתוך כלי דם בבטן מתחתיה (איור 1 א-C).
      הערה: מאחר שהתשואה של acini לבלב מחיה אחת היא גבוהה, אפשר להימנע מלאסוף את כל רקמת הלבלב כדי למנוע איסוף רקמות אחרות.
3. עיכול Collagenase
   1. יש לשטוף את הלבלב כמה פעמים במדיום resuspension מחוממות ל37 מעלות צלזיוס ולהסיר חלקים הנותרים של אי לבלברקמות. לטבול את הלבלב ב~ 5 מ"ל של מדיום עיכול מחומם מראש בבקבוקון נצנץ 20 מ"ל. לרכך את הלבלב לחתיכות של 1-3mm. למקם אותו באמבט מים מחומם (בצורה אופטימלית תחת תסיסה של ~ 100 סל"ד). כדי להאיץ את תהליך העיכול, פיפטה רקמה עד מתעכל ומטה אחת לכמה דקות.
      הערה: משך הזמן של עיכול collagenase תלוי בעיקר בריכוז collagenase ועל כמות הכוח מכאני מיושמת על הרקמה. שימוש ב0.75 מ"ג / מ"ל ​​collagenase כ 15 דקות וpipetting הרקמה עם טפטפת 5 מ"ל קלקר עם 2 מ"מ פתח כל 3 - 5 דקות, וכתוצאה מכך acini של 10 - 30 תאים. בעקבות עיכול, ההשעיה מופיעה עכורות המכילה חתיכות גלויות של רקמה. מאז יעילות collagenases משתנה בין סוגים מסחריים שונים והרבה, לקבוע את העיתוי של מערכת עיכול באופן אמפירי.
   2. כביסה וסינון
      1. העברת הרקמה מתעכל לתוך צינור 50 מ"ל ולסיים חפירהestion ידי הוספת 45 מ"ל של מדיום resuspension. סנן את ההשעיה דרך גס (~ 1 מ"מ) רשת מתכת לתוך צינור טרי. צנטריפוגה הזרימה דרך ב100 × גרם במשך 3 דקות.
      2. בטל supernatant וresuspended הלבלב מתעכל ב50 מ"ל של מדיום resuspension. סנן את ההשעיה דרך רשת ניילון 70 או 100 מיקרומטר. צנטריפוגה כמו קודם.
      3. על מנת להסיר acini הצף, פגום, לבטל את supernatant וresuspend רקמת הלבלב ב3 - 5 מ"ל של מדיום resuspension. החל 1 מ"ל חלקים של acini הלבלב לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל מלא 7 מ"ל של מדיום resuspension. לאפשר acini להסתפק ב2 - 3 דקות. לאסוף acini שהתיישב בחלק התחתון של הצינור עם טפטפת מ"ל 1, וחזור על שלב זה 2 - 3 פעמים.
      4. צפה acini הלבלב תחת מיקרוסקופ אור או לנתח כדי לבדוק את מצבם. באיור 2, להתבונן על טוהר הבידוד ונזקים שנגרם לתאי duriבידוד ng. השתמש acini אלה באופן מיידי או תרבות עד 20 שעה.

.2 עמילאז Assay ההפרשה

הערה: assay הפרשת עמילאז משמש כמדד גלובלי ליכולת ההפרשה של acini לבלב. זו מושגת על ידי איסוף המדיום שבו acini הלבלב הודגרו, וקביעת פעילות עמילאז של המדיום, בדרך כלל על ידי שימוש בערכה מסחרית.

1. לקבוע את מספר תנאי ניסוי לבדיקה (לעומת למשל שאינו מגורה המגורה). השתמש לפחות שלושה משכפל עבור כל מצב. בנוסף, להוסיף סט של משכפל כדי לקבוע את התוכן הכולל הסלולרי עמילאז (מדגם 'סך הכל') ומערכת לפעילות עמילאז של המדיום (מדגם 'אפס'). תווית צלחת רב גם שבassay יתקיים, ושני סטים של microtubes לכל אחת מהחזרות לשימוש.
   צלחת 12- או 24 גם: הערהים יכול לשמש כדי לפקח על 1 ו0.5 מ"ל של השעיות acinar, בהתאמה.
2. שטוף את acini פעמיים ב30 מ"ל של מדיום resuspension KRBH דגירה אותם במדיום resuspension ל30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לצלחת רב גם להוסיף טיפת 10μl של secretagogue להגיע הריכוז הסופי המתאים.
3. acini הלבלב להגיב לשיפוע של secretagogue באופן דו phasic. הריכוזים עם ערכי הפרשה אופטימליים הם 50 - 100 PM של כולציסטוקינין (CCK) ו1μM של Carbachol (איור 3 א) ^5.
4. לשטוף וresuspend acini במדיום resuspension. ודא שacini מופצים homogenously בכמויות שווים ההשעיה וaliquot של השעיה לתוך הצלחת רבות גם ולתוך microtubes כותרת total' '. דגירה את הצלחת ל30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. (רצוי באמבט מים תחת תסיסה קלה (~ 50 סל"ד)).
   הערה: מספר acini המדויק עשוי להשתנות בין experiments אבל צריך להיות דומה בחזרות בתוך כל ניסוי. לפיכך, aliquoting המדויק של ההשעיה acini הוא קריטי להשוואה בין משכפל ותנאים שונים.
5. במהלך הדגירה, לייצר 'סך הכל' ו 'אפס' דגימות. צנטריפוגה microtubes 'סך הכל' לכמה שניות ב5,000 × גרם ולהסיר 50 μl מsupernatant לתוך microtubes 'zero' שכותרתו ומניחה אותם על 4 מעלות צלזיוס. Lyse acini בדגימות "בסך הכל" על ידי הוספת טריטון X-100 microtubes להגיע ריכוז סופי של 1%. מערבולת microtubes במרץ.
   הערה: Aliquote 'סך הכל' משכפל דומה למשכפל של הניסוי. Lysing acini, מוביל לשחרור בסך הכל תוכן עמילאז. לחלופין, לאסוף את acini בכל מצב וlyse בסוף הניסוי, כדי לקבוע את התוכן הסלולרי של כל לשכפל.
6. לאסוף את רוב i ההשעיה acinarn כדי הסט הראשון של microtubes שכותרתו מראש. צנטריפוגה microtubes לכמה שניות ב5,000 × גרם. מעבירים את supernatant לסט השני של microtubes שכותרתו מראש.
7. Assay supernatant לפעילות עמילאז עם ערכה מסחרית. חישוב אחוזי עמילאז מופרשים.
   הערה: חשוב מאוד לקרוא את פעילות עמילאז בטווח ליניארי שלה. להציג את האחוז של עמילאז מופרש כאחוזים מעמילאז שוחררו מתוכן כולל ראשוני. הפחת את רמת עמילאז הרקע של מדיום מכל שלושה עותקים ולחלק אותו על ידי התוכן הכולל הראשוני דומה המנורמל.

.3 הדמיה חיה של הפרשת לבלב

הפרשה מacini הלבלב יכולה להיות במעקב באופן ישיר על ידי הדמיה לחיות. שימוש בצבעי ניאון שונים וחיישנים, הדמיה חיה מאפשרת האפיון של הפרשה ברזולוציה משנה הסלולר.

1. להכין מדיום resuspension טרי מחומצן כמו שאניn צעד 1.1 ולהביא אותו ל37 ºC. הגדר את המיקרוסקופ, ואם מצוידים בבקר טמפרטורה, להתאים אותו ל37 ºC.
2. שוטפים את תאי acinar ב30 מ"ל של מדיום resuspension ולמקם אותם בשקופית זכוכית או פלסטיק. הערה: אם צבעי lipophilic ישמשו לתייג לקרום פלזמה שכותרתו עם צבעי lipophilic, להכתים את acini על כך שלא יותר מ 5 דקות כדי למנוע תיוג של קרומים פנימיים על ידי אנדוציטוזה. לאורך כל העבודה, להתמודד עם acini בעדינות ולהימנע pipetting מוגזם.
3. ברגע שבמיקרוסקופ, acini תמונת המורפולוגיה שלו ברור, ולהימנע מהדמיה של acini המציג blebs basolateral או וקואולות תאית. הוסף טיפת secretagogue חכם או על ידי שימוש בתא זלוף, או במהלך או מייד לפני תחילתו של הדמיה.
   הערה: עדשות הגדלה גבוהות עם פתחים מספריים גבוהים (למשל × 63 / 1.4 או × 100 / 1.4) מומלץ לבחון מבני subcellular.

4. O / N תרבות של הלבלב acini (טכניקת תרבית תאים חלופי)

הערה: O / culturing N משמש לעתים קרובות לזיהום בנגיף Adeno. הזיהום מתבצע ב10 ⁶ -10 ⁷ pfu מ"ל / ל9 - 16 שעות לפני הבדיקה.

1. acini לבלב תרבות עד 20 שעה. acini Resuspended מתקבל מלבלב יחיד ב25 מ"ל מדיום תרבות (DMEM בתוספת עוברי עגל בסרום (FCS) (5%), נתרן פירובט (1%), אנטיביוטיקה (1%), L-גלוטמין (0.5%), BSA (10 מ"ג / מ"ל) וSTI (0.2 מ"ג / מ"ל), ומחולק לחמש 10cm צלחות. להדביק acini עם וירוס בקבינט ביו בטיחות ברמת 3.
2. מודגרות acini הלבלב ב37ºC באוויר humidified 5% CO _2. לאפשר acini להתאושש במדיום resuspension מחומצן ל30 דקות לפני הבדיקה שלאחר מכן ^3,8.

תוצאות

acini הלבלב שבודדו כראוי להציג מורפולוגיה סטריאוטיפית כאשר נצפים על ידי אור מועבר. תחומים basolateral שלהם צריכים להופיע בסיבוב ונטול blebs. תחום הפסגה מוקף במאות שלפוחית ​​הפרשה ומופיע בצבע כהה (איור 2 א, ב '). הגרעינים נמצאים בסיס לאזור לפוחי. פסולת תא ומרכיבים של מ...

Discussion

חוץ תרבות vivo לשעבר, הגדרות חלופיות ללימוד הפרשת אקסוקרינית כוללות מיקרוסקופיה ומדידת intravital של נוזלים מצינור הלבלב. מיקרוסקופיה Intravital הוצגה לפעול גם בעכבר בלוטות רוק ^10. שיטה זו יכולה להקליט את ההפרשה בזמן אמת בחיה שלמה, אבל מוגבלת ברזולוציה שלה ועל ידי האמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808