La evaluación de la capacidad secretora de las células pancreáticas acinares

Resumen

Acinos pancreáticos aislados conservan su morfología y actividad in vivo y ofrecen maneras de gran alcance para el seguimiento y la manipulación de la secreción. Este trabajo demuestra cómo acinos se pueden aislar a partir del páncreas de ratón, y cómo se pueden evaluar sus capacidades secretoras.

Resumen

Células acinares pancreáticas producen y secretan las enzimas digestivas. Estas células están organizadas como un grupo que forma un lumen y acciones conjuntas. Este trabajo demuestra cómo la capacidad secretora de estas células puede evaluarse por cultivo de acinos aislados. La configuración es ventajosa, ya aislado acinos, que conservan muchas de las características del páncreas exocrino intacta puede ser manipulado y controlado más fácilmente que en el animal entero. Aislamiento adecuado de los acinos pancreáticos es un requisito clave para que el cultivo ex vivo representará a la naturaleza in vivo de los acinos. El protocolo demuestra cómo aislar acinos intacta desde el páncreas de ratón. Posteriormente, se presentan dos métodos complementarios para la evaluación de la secreción pancreática. El ensayo de secreción de amilasa sirve como una medida global, mientras que la imagen directa de la secreción pancreática permite la caracterización de la secreción a una resolución subcelular. Colectivamente, las técnicas PresenTed aquí, permite un amplio espectro de experimentos para estudiar la secreción exocrina.

Introducción

El páncreas exocrino constituye la mayor parte de la masa del páncreas de mamíferos y está dedicada a la producción y secreción de enzimas digestivas ^1. La unidad funcional del páncreas exocrino, el acino, es un grupo de células epiteliales que forman y comparte un lumen conjunta. Tras la estimulación hormonal o neuronal, vesículas llenas de enzimas son transportados a la superficie celular apical, fusible con ella y expulsan su contenido en el lumen ^1-3. Las enzimas secretadas se escurrieron entonces por un conjunto de coalescencia de los conductos en el intestino delgado, donde se catalizan la descomposición de los alimentos en nutrientes.

Este video muestra cómo acinos intacta se aisló de todo el páncreas y cómo su capacidad secretora se puede evaluar. Utilizando esta configuración, la secreción pancreática se cuantifica midiendo la cantidad relativa de amilasa que se publicó después de la estimulación. Alternativamente, la secreción se pueden obtener imágenes en vivo por el uso de diferentessensores y colorantes.

La configuración ex vivo de acinos pancreáticos es ventajoso ya aislado acinos, que conservan muchas de las características del páncreas intactos, puede ser manipulado y controlado más fácilmente que en el animal entero ^4-6. Esta configuración fue desarrollado originalmente en la década de 1970 y fue puesto prorrogado por el estudio de varios tejidos exocrinas, como las glándulas salivales y mamarias ^3-7. En particular, permite el estudio de la secreción con un mínimo de interferencia a las complejas organizaciones celulares de estos epitelios polarizados.

Protocolo

NOTA: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en el Instituto Weizmann de Ciencias.

1. Preparación de muestras

1. Aislamiento de acinos pancreáticos
   1. Preparar 300 ml de bicarbonato fresco Krebs-Ringer HEPES (KRBH) medio antes de empezar. Mezclar NaCl 140 mM, KCl 4,7 mM, 1,16 mM _{MgCl2, CaCl2} 1 mM, 11 mM de glucosa, 10 mM HEPES. Añadir albúmina de suero bovino (BSA) y el inhibidor de 0,1 mg / ml de tripsina de soja (STI) (medio de resuspensión). Preparar de 5 - 10 ml de la resuspensión medio suplementado con colagenasa (~ 0,75 mg / ml) (medio de digestión).
   2. Oxigenar el medio KRB durante ~ 30 min. Añadir BSA después de la oxigenación para prevenir el burbujeo. Traiga resuspensión y digestión medios a 37 ° C. NOTA: oxigenar el medio reduce la mortalidad celular y mejora la respuesta a secretagogos. El efecto de la oxigenación es evidente por lo menos durante 6 horas.
   3. sacrificar el ratón por dislocación cervical o asfixia con _CO2, según las directrices de cuidado de los animales institucionales. Colocar el animal sacrificado en su parte posterior, adjuntarlo a un cojín de disección y limpiar la superficie abdominal con etanol.
      NOTA: Con el fin de evitar la contaminación, autoclave las herramientas de disección y el agua utilizada para el medio KRBH antes de su uso. Filtra medio KRBH a través de un filtro de 0,2 micras. Antes de la escisión del páncreas enjuagar las herramientas de disección con 70% de etanol y llevar a cabo la disección en un banco limpio. Realizar las infecciones virales en un gabinete de bioseguridad de nivel 3. Añadir antibióticos a la / medio de cultivo N O (ver sección 4).
2. La escisión del páncreas murino
   1. Incisión ampliamente la piel abdominal y la capa subcutánea. Identificar el hígado, el estómago, el intestino, el páncreas y el bazo (Figura 1). NOTA: En los siguientes pasos, manejar el tejido pancreático con cuidado y no aplique excesiva forc mecánicaE para prevenir auto-digestión del tejido y la muerte celular.
   2. Mediante el uso de dos pinzas romas, sacar el intestino delgado. Comienza en el extremo proximal del intestino pequeño, cerca de la salida del estómago. Separar el páncreas a partir del intestino y retener dentro de la cavidad corporal. Una vez que llega al intestino grueso, notar un tejido conectivo de color rosa / blanco. No lo confunda con el páncreas.
   3. Desactive mayor cantidad de tejido pancreático posible sin recoger el tejido graso o conectivo. Retire el páncreas separándolo del bazo y el estómago y el corte de los vasos sanguíneos abdominales debajo de ella (Figura 1A-C).
      NOTA: Debido a que el rendimiento de los acinos pancreáticos de un solo animal es alta, uno puede abstenerse de recolectar todo el tejido pancreático para evitar que la recolección de otros tejidos.
3. Digestión con colagenasa
   1. Enjuague el páncreas un par de veces en medio de resuspensión calentado a 37 ° C y retirar el resto de partes de no pancreáticatejidos. Sumerja el páncreas en ~ 5 ml de medio de digestión precalentado en un vial de centelleo de 20 ml. Picar el páncreas para piezas de 1-3 mm. Colóquelo en un baño de agua caliente (de manera óptima con agitación de ~ 100 rpm). Para acelerar la digestión, la pipeta hasta el tejido digerido y abajo una vez cada pocos minutos.
      NOTA: La duración de la digestión con colagenasa depende principalmente de la concentración de colagenasa y de la cantidad de fuerza mecánica aplicada sobre el tejido. El uso de 0,75 mg / ml de colagenasa durante aproximadamente 15 min y pipeteando el tejido con una pipeta de 5 ml de poliestireno con un orificio de 2 mm cada 3 - 5 min, resultando en acinos de 10 - 30 células. Después de la digestión, la suspensión aparece turbia que contiene fragmentos visibles de tejido. Desde colagenasas eficiencia varía entre los diferentes tipos comerciales y lotes, determinar el momento de la digestión empíricamente.
   2. Lavado y filtrado
      1. Transferir el tejido digerido en un tubo de 50 ml y terminar excavaciónestion añadiendo 45 ml de medio de resuspensión. Se filtra la suspensión a través de una gruesa (~ 1 mm) de malla metálica en un tubo nuevo. Centrifugar el flujo a través a 100 × g durante 3 min.
      2. Descartar el sobrenadante y se resuspendió el páncreas digeridos en 50 ml de medio de resuspensión. Se filtra la suspensión a través de una malla de nylon 70 o 100 micras. Centrifugar como antes.
      3. Con el fin de eliminar flotante, acinos dañado, descartar el sobrenadante y resuspender el tejido pancreático en 3 - 5 ml de medio de resuspensión. Aplicar 1 ml de la acinos pancreáticos en 15 ml tubos cónicos llenos de 7 ml de medio de resuspensión. Permita que los acinos se asiente durante 2 - 3 min. Recoger los acinos que se han asentado en la parte inferior del tubo con una pipeta de 1 ml, y repetir este paso 2 - 3 veces.
      4. Ver el acinos pancreáticos bajo un microscopio de luz o de disección para comprobar su estado. En la Figura 2, observar la pureza de aislamiento y daños infligidos a las células duriaislamiento ng. Utilice estos acinos inmediata o la cultura para un máximo de 20 horas.

2. amilasa Secreción Ensayo

NOTA: El ensayo de secreción de amilasa sirve como una medida global de la capacidad secretora de acinos pancreáticos. Esto se consigue recogiendo el medio en el que se incubaron los acinos pancreáticos, y la determinación de la actividad de la amilasa del medio, por lo general mediante el uso de un kit comercial.

1. Determinar el número de condiciones experimentales que deben examinarse (frente a por ejemplo no estimulado-estimulado). Use al menos tres réplicas para cada condición. Además, añadir un conjunto de réplicas para determinar el contenido celular total amilasa (muestra "total") y un conjunto para la actividad de la amilasa del medio ("cero" de la muestra). Etiquetar una placa de múltiples pocillos en la que se llevará a cabo el ensayo, y dos juegos de microtubos para cada una de las repeticiones que se utilizará.
   NOTA: de 12 ó 24 pocillos placas se puede utilizar para controlar 1 y 0,5 ml de suspensiones acinares, respectivamente.
2. Lave los acinos dos veces en 30 ml de medio de resuspensión KRBH e incubar en medio de resuspensión durante 30 minutos a 37 ° C. Para la placa de múltiples pocillos añadir una gota de 10μl secretagogo para alcanzar la concentración final apropiada.
3. Acinos pancreáticos responden a un gradiente de secretagogo de una manera bifásica. Las concentraciones con valores óptimos de secreción son 50 - 100 pM de colecistoquinina (CCK) y 1μM de carbacol (Figura 3A) ^5.
4. Lavar y volver a suspender los acinos en medio de resuspensión. Asegúrese de que los acinos se distribuyen homogéneamente en suspensión y las alícuotas iguales cantidades de suspensión en la placa de múltiples pocillos y en los "microtubos total' marcado. Incubar la placa durante 30 minutos a 37 ° C. (Preferiblemente en un baño de agua bajo agitación suave (~ 50 rpm)).
   NOTA: El número exacto de los acinos puede variar entre experiments, pero deben ser similares en las réplicas en cada experimento. Por lo tanto, precisa alícuotas de la suspensión acinos es crítico para la comparación entre las diferentes repeticiones y condiciones.
5. Durante la incubación, producir el "total" y "cero" muestras. Centrifugar los microtubos 'integrales' para unos segundos a 5000 × g y eliminar 50 l del sobrenadante en "microtubos-etiquetados zero' y colocarlos a 4 ° C. Lyse los acinos en las muestras "total" mediante la adición de Triton X-100 a los microtubos para llegar a una concentración final de 1%. Vortex los microtubos vigorosamente.
   NOTA: aliquote el "total" replica similar a las réplicas del experimento. Lisis de los acinos, conduce a la liberación del contenido total de amilasa. Alternativamente, recoger los acinos en cada condición y se lisan al final del experimento, para determinar el contenido celular de cada réplica.
6. Recoger la mayor parte de la suspensión i acinarnto el primer conjunto de los microtubos pre-etiquetados. Centrifugar los microtubos durante unos segundos a 5000 × g. Transferir el sobrenadante en el segundo conjunto de los microtubos pre-etiquetados.
7. Ensayar el sobrenadante para la actividad de la amilasa con un kit comercial. Calcular el porcentaje de la amilasa secretada.
   NOTA: Es muy importante leer la actividad de la amilasa en su rango lineal. Presentar el porcentaje de la amilasa secretada como el porcentaje de la amilasa liberada de contenido total inicial. Reste el nivel de fondo de la amilasa del medio de cada uno por triplicado y se divide por el contenido total inicial similar normalizado.

3. imágenes en vivo de la secreción pancreática

La secreción de acinos pancreáticos se puede controlar directamente por imágenes en vivo. Utilizando varios colorantes fluorescentes y sensores, imágenes en directo permite la caracterización de la secreción a una resolución subcelular.

1. Preparar medio de resuspensión oxigenada como in paso 1.1 y llevarlo a 37 º C. Ajuste el microscopio, y si está equipado con un controlador de temperatura, ajuste a 37 ° C.
2. Lavar las células acinares en 30 ml de medio de resuspensión y colocarlos en un vaso de plástico o diapositiva. Nota: Si colorantes lipófilos se van a utilizar para etiquetar Para membrana plasmática marcada con colorantes lipófilos, manchar los acinos por no más de 5 minutos para evitar el etiquetado de las membranas internas por endocitosis. A lo largo de la obra, manejar los acinos con suavidad y evitar pipeteo excesiva.
3. Una vez en el microscopio, acinos imagen cuya morfología es clara, y evitar la proyección de imagen de acinos que muestran ampollas basolateral o vacuolas intracelulares. Añadir gota secretagogo de sabia o mediante el uso de una cámara de perfusión, ya sea durante o inmediatamente antes de la iniciación de la formación de imágenes.
   NOTA: A altas lentes de aumento con altas aperturas numéricas (por ejemplo × 63 / 1.4 o × 100 / 1,4) se recomienda para observar estructuras subcelulares.

4. O / N de Cultura pancreático Acinos (Cell alternativo Técnica Cultura)

NOTA: O / N de cultivo se utiliza a menudo para la infección por virus adeno. La infección se llevó a cabo a 10 ⁶ -10 ⁷ pfu / ml para 9 - 16 horas antes del examen.

1. Cultura acinos pancreáticos para un máximo de 20 horas. Acinos resuspendidas obtenidos a partir de un único páncreas en 25 ml de medio de cultivo (DMEM complementado con suero de ternero fetal (FCS) (5%), piruvato de sodio (1%), antibióticos (1%), L-glutamina (0,5%), BSA (10 mg / ml) y STI (0,2 mg / ml), y se divide a cinco placas de 10 cm. infectan los acinos con el virus en un gabinete de seguridad biológica de nivel 3.
2. Se incubó acinos pancreáticos a 37 ° C en un aire humidificado 5% de CO _2. Permitir acinos se recuperen en medio de resuspensión oxigenada durante 30 minutos antes de su examen ulterior ^3,8.

Resultados

Acinos pancreáticos que fueron aisladas adecuadamente mostrar una morfología estereotipado cuando se observa con luz transmitida. Sus dominios basolateral deben aparecer redonda y carente de ampollas. El dominio apical está rodeado de cientos de vesículas secretoras y aparece de color más oscuro (Figura 2A, B). Los núcleos se encuentran basal a la zona vesicular. Escombros y componentes del sistema ductal pancreático y del páncreas endocrino, que se puede detectar en las primeras etapas de aisla...

Discusión

Además del cultivo ex vivo, configuraciones alternativas para el estudio de la secreción exocrina incluyen microscopía intravital y medición de fluidos desde el conducto pancreático. Microscopía intravital se demostró que operar bien en el ratón glándulas salivales ^10. Este método puede grabar la secreción en tiempo real en el animal intacto, pero está limitado en su resolución y por los medios para manipular el tejido exocrino. La evaluación de la secreción mediante la recopilación d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808