Beurteilung der sekretorischen Kapazität von Azinuszellen des Pankreas

Zusammenfassung

Isoliert Pankreasazini behalten ihre in-vivo-Morphologie und Aktivität und bieten leistungsfähige Möglichkeiten zur Überwachung und Manipulation Sekretion. Diese Arbeit zeigt, wie Acini von der Bauchspeicheldrüse der Maus isoliert werden, und wie die sekretorischen Fähigkeiten beurteilt werden kann.

Zusammenfassung

Azinuszellen des Pankreas produzieren und sezernieren Verdauungsenzyme. Diese Zellen werden als Cluster, die eine gemeinsame Lumen bildet und Aktien organisiert. Diese Arbeit zeigt, wie die sekretorische Fähigkeit dieser Zellen durch Kultur von isolierten Acini bewertet. Das Setup ist vorteilhaft, da isolierte Azini, die viele Eigenschaften des intakten exokrinen Pankreas behalten können manipuliert und leichter überwacht als in der gesamten Tier werden. Die richtige Isolierung von Pankreasazini ist eine wesentliche Voraussetzung, so dass der Ex-vivo-Kultur wird die in-vivo Natur der Acini darstellen. Das Protokoll zeigt, wie intakt Acini von der Maus Bauchspeicheldrüse zu isolieren. Anschließend werden zwei komplementäre Verfahren zur Bewertung Pankreassekretion dargestellt. Die Amylase-Sekretion Assay dient als globales Maß, während die direkte Abbildung von Pankreas-Sekretion ermöglicht die Charakterisierung der Sekretion bei einer subzellulärer Auflösung. Gemeinsam presen die TechnikenTed hier ermöglichen ein breites Spektrum von Experimenten zur exokrinen Sekretion studieren.

Einleitung

Exokrinen Pankreas bildet den größten Teil der Masse des Säugerpankreas und arbeitet an der Produktion und Sekretion von Verdauungsenzymen ^1. Die Funktionseinheit des exokrinen Pankreas, Azinus, ist ein Cluster von Epithelzellen, die ein gemeinsames Lumen bildet und Anteile. Auf hormonelle oder neuronale Stimulation werden Vesikel mit Enzymen gefüllt, um der apikalen Zelloberfläche transportiert mit ihm, Sicherung und vertreiben ihre Inhalte in das Lumen ^1-3. Die sekretierten Enzyme werden dann durch einen Koaleszenz-Satzes von Kanälen in den Dünndarm, wo sie den Abbau von Lebensmitteln in Nährstoffe katalysieren abgelassen.

Dieses Video zeigt, wie intakt Azini werden von der ganzen Bauchspeicheldrüse isoliert und wie ihre sekretorischen Kapazität beurteilt werden kann. Mit diesem Setup wird Pankreas-Sekretion durch Messung der relativen Menge an Amylase, die nach Stimulation veröffentlicht wurde quantifiziert. Alternativ kann die Sekretion Live durch die Verwendung von verschiedenen abzubildendenSensoren und Farbstoffe.

Die Ex-vivo-Setup Pankreasazini ist vorteilhaft, da isolierte Azini, die viele Eigenschaften der intakten Bauchspeicheldrüse behalten, manipuliert und leichter überwacht als in der gesamten Tier ^4-6 werden. Dieser Aufbau wurde ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt und da bei der Untersuchung der verschiedenen exokrinen Gewebe ausgedehnt wie der Speichel und Brustdrüsen ^3-7. Bemerkenswerterweise ermöglicht es die Untersuchung der Sekretion mit minimaler Störung der komplexen Zellverbände dieser polarisierten Epithelien.

Protokoll

HINWEIS: Verfahren mit tierischen Patienten wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) am Weizmann Institute of Science genehmigt worden.

1. Probenvorbereitung

1. Isolierung von Pankreasazini
   1. Bereiten Sie 300 ml frischem Krebs-Ringer-Bicarbonat HEPES (KRBH) Medium vor dem Start. Mischen 140 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,16 mM MgCl _2, 1 mM CaCl _2, 11 mM Glucose, 10 mM HEPES. Hinzufügen Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mg / ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI) (Resuspensionsmedium). Bereiten 5 - 10 ml Resuspensionsmedium mit Kollagenase (~ 0,75 mg / ml) (Digestionsmedium) ergänzt.
   2. Oxygenieren die KRB Medium für ~ 30 min. Fügen BSA nach Sauerstoffblasenbildung zu verhindern. Bringen Aufwirbelung und Verdauung Medien bis 37 ° C. HINWEIS: Sauerstoffanreicherung des Mediums reduziert Zellmortalität und verbessert Reaktionsfähigkeit auf die Sekretion. Die Wirkung der Oxygenierung mindestens 6 h deutlich.
   3. Opfer der Maus durch Genickbruch oder CO ₂ Erstickung, nach institutionellen Tierpflege-Richtlinien. Legen Sie das Tier geopfert auf dem Rücken, verbinden Sie es mit einer Dissektion Pad und reinigen Sie die Bauchdecke mit Ethanol.
      HINWEIS: Um Verunreinigungen zu vermeiden, Autoklaven werden die Dissektion Werkzeuge und die für KRBH Medium vor Gebrauch verwendete Wasser. Filtern KRBH Medium durch ein 0,2 um-Filter. Vor der Entfernung der Bauchspeicheldrüse die Dissektion Werkzeuge mit 70% Ethanol spülen und durchzuführen Dissektion auf eine saubere Bank. Durchführung von Virusinfektionen in einem Level 3 Bio-Sicherheitsschrank. Fügen Antibiotika auf den O / N Kulturmedium (siehe Abschnitt 4).
2. Ausschneiden des murinen Pankreas
   1. Schnitt weit die Bauchhaut und Unterhaut. Identifizieren Sie die Leber, Magen, Darm, Bauchspeicheldrüse und Milz (Abbildung 1). HINWEIS: In den folgenden Schritten, behandeln die Pankreasgewebe vorsichtig und vermeiden Sie übermäßigen mechanischen force auto-Verdauung des Gewebes und Zelltod verhindert.
   2. Durch die Verwendung von zwei stumpfen Pinzette, ziehen Sie den Dünndarm. Beginnen an den Dünndarm proximalen Ende, nahe dem Ausgang aus dem Magen. Trenne die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm und bewahren Sie sie in der Körperhöhle. Nach Erreichen des Dickdarms, bemerken eine rosa / weiß Bindegewebe. Nicht zu verwechseln mit der Bauchspeicheldrüse.
   3. Zu löschen, so viel Pankreasgewebe wie möglich, ohne das Sammeln Fett oder Bindegewebe. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse durch Lösen aus der Milz und Magen und Schneiden der Bauchblutgefäße darunter (Abbildung 1A-C).
      HINWEIS: Da die Ausbeute an Pankreasazini von einem einzigen Tier hoch ist, kann man von Sammeln aller Pankreasgewebe um das Sammeln anderer Gewebe zu verhindern, zu unterlassen.
3. Collagenaseverdau
   1. Spülen Sie die Bauchspeicheldrüse ein paar Mal in Resuspensionsmedium auf 37 ° C erhitzt und entfernen übrigen Teile des nicht-Pankreas-Gewebe. Tauchen Sie in die Bauchspeicheldrüse ~ 5 ml vorgewärmten Verdauung Medium in einem 20 ml Szintillationsfläschchen. Hackfleisch in der Bauchspeicheldrüse an Stücke von 1-3 mm. Legen Sie sie in einem beheizten Wasserbad (optimal unter Rühren von ~ 100 rpm). , Um die Verdauung zu beschleunigen, Pipette der verdauten Gewebe auf und ab, wenn alle paar Minuten.
      HINWEIS: Die Dauer Collagenaseverdau hängt hauptsächlich von der Kollagenase-Konzentration und der Menge der mechanischen Kraft auf das Gewebe aufgebracht. Verwendung von 0,75 mg / ml Collagenase für ungefähr 15 min und Pipettieren der Gewebe mit einer 5 ml Polystyrolpipette mit einer 2 mm Düse alle 3 - 5 Minuten, was zu Acini 10-30 Zellen. Nach der Verdauung, wird die Suspension trübe, die sichtbare Gewebestücke. Seit Collagenasen Effizienz variiert zwischen verschiedenen Handelstypen und viele, bestimmen den Zeitpunkt der Verdauung empirisch.
   2. Waschen und Filtrieren
      1. Übertragen Sie das verdaut Gewebe in einem 50-ml-Tube und beenden digestion durch Zugabe von 45 ml Medium resuspendiert. Filtern der Suspension durch ein grobes (~ 1 mm) Metallnetz in ein frisches Röhrchen. Zentrifugieren des Durchflusses bei 100 × g für 3 min.
      2. Überstand verwerfen und suspendiert die Bauchspeicheldrüse verdaut in 50 ml Resuspensionsmedium. Filtern der Suspension durch ein 70 oder 100 um Nylonnetz. Zentrifuge vor.
      3. Um schwimmende, beschädigte Acini zu entfernen, den Überstand verwerfen und resuspendieren Pankreasgewebe in 3-5 ml Resuspensionsmedium. Es wird 1 ml der Pankreas-Acini in 15 ml konischen Röhrchen mit 7 ml Resuspensionsmedium gefüllt. Lassen Sie die Acini für 2 beigelegt - 3 min. Sammeln Sie die Acini, die am Boden der Röhre mit einer 1 ml Pipette angesiedelt haben, und wiederholen Sie diesen Schritt 2 - 3 mal.
      4. Sehen Sie sich die Pankreasazini unter einem Lichtmikroskop oder sezieren, um ihren Zustand zu prüfen. In Abbildung 2, beobachten die Reinheit der Isolation und der Schäden auf die Zellen Duri zugefügtng Isolation. Verwenden Sie diese Acini sofort oder Kultur für bis zu 20 Stunden.

2. Amylase Sekretion Assay

HINWEIS: Die Amylase-Sekretion Assay dient als globales Maß für die sekretorische Kapazität von Pankreasazini. Dies wird durch Sammeln des Mediums, in dem das Pankreas-Acini wurden inkubiert, und die Bestimmung der Amylaseaktivität des Mediums, in der Regel unter Verwendung eines kommerziellen Kits erreicht.

1. Bestimmen der Anzahl von experimentellen Bedingungen untersucht werden (zB nicht-stimulierten versus stimuliert). Verwenden Sie mindestens drei Wiederholungen für jede Bedingung. Außerdem fügen Sie eine Reihe von Wiederholungen, um die Gesamtzell Amylase-Gehalt ('Total' Probe) und einen Satz für die Amylase-Aktivität des Mediums ("Null"-Probe) zu bestimmen. Label eine Multi-Well-Platte, in der der Assay durchgeführt werden, und zwei Sätze von Mikroröhrchen für jede der Wiederholungen verwendet werden.
   HINWEIS: 12 oder 24-Well-Plattes kann zur Überwachung 1 und 0,5 ml acinar Suspensionen, bzw. werden.
2. Zweimal waschen Sie die Acini in 30 ml KRBH Resuspensionsmedium und Inkubation sie in Resuspensionsmedium für 30 min bei 37 ° C. Um die Multi-Well-Platte fügen Sie ein 10 ul Tropfen secretagogue die angemessene endgültige Konzentration zu erreichen.
3. Pankreasazini reagieren auf eine Steigung von secretagogue in einem zweiphasigen Weise. Die Konzentrationen optimale Sekretion Werte von 50 bis 100 pM von Cholecystokinin (CCK) und 1 uM Carbachol (3A) ^5.
4. Waschen und resuspendieren Acini in Resuspensionsmedium. Stellen Sie sicher, dass die Acini sind homogen in der Suspension und aliquoten gleiche Mengen von Suspension in die Multi-Well-Platte und in die 'total'-markierten Mikroröhrchen verteilt. Inkubiere die Platte für 30 min bei 37 ° C aufweist. (Vorzugsweise in einem Wasserbad unter leichtem Schütteln (~ 50 min)).
   HINWEIS: Die genaue Zahl der Acini zwischen experimen variierents sollte aber ähnlich in Wiederholungen innerhalb der einzelnen Experiment. So ist präzise Aliquotierung der Acini Suspension entscheidend für den Vergleich zwischen den verschiedenen Wiederholungen und Bedingungen.
5. Während der Inkubation produzieren die "Gesamt" und "Null"-Proben. Zentrifugieren Sie die "Gesamt" Mikroröhrchen für ein paar Sekunden bei 5.000 × g und entfernen 50 ul aus dem Überstand in 'zero'-markierten Mikroröhrchen und legen Sie sie bei 4 ° C. Lyse der Acini in den "Gesamt"-Proben durch Zugabe von Triton X-100 zu den Mikroröhrchen, um eine endgültige Konzentration von 1% zu erreichen. Mischen Sie den Mikroröhrchen kräftig.
   HINWEIS: Aliquote "Insgesamt" repliziert ähnlich wie bei den Wiederholungen des Experiments. Lyse der Azini, führt zur Freisetzung des gesamten Amylase-Gehalt. Alternativ erfassen die Acini zu jedem Zustand und Lyse am Ende des Experiments, um den zellulären Gehalt an jede Wiederholung zu bestimmen.
6. Sammeln Sie die meisten der acinar Suspension inin der ersten Reihe von den pre-markierten Mikroröhrchen. Zentrifugieren der Mikroröhren für einige Sekunden bei 5000 × g auf. Den Überstand in den zweiten Satz der vorge markierten Mikroröhrchen.
7. Assay des Überstands für die Amylase-Aktivität mit einem handelsüblichen Kit. Berechnen Sie den Prozentsatz der Amylase sezerniert.
   Hinweis: Es ist entscheidend, die Amylase-Aktivität in seinem linearen Bereich zu lesen. Präsentieren der Prozentsatz der Amylase als Prozentsatz der Amylase von der anfänglichen Gesamtgehalt freigesetzt sezerniert. Subtrahieren Sie die Hintergrundebene Amylase des Mediums aus jeder dreifacher Ausfertigung und teilen sie durch die ebenfalls normierten Anfangsgesamtgehalt.

3. Live-Imaging von Pankreas-Sekretion

Sekretion aus Pankreasazini kann direkt durch Live-Bildgebung überwacht werden. Mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen und Sensoren ermöglicht die Live-Darstellung die Charakterisierung der Sekretion bei einer subzellulärer Auflösung.

1. Frisch herstellen Sauerstoff angereichert Resuspensionsmedium wie ichSchritt n 1.1 und bringen es auf 37 ° C. Stellen Sie das Mikroskop, und wenn mit einem Temperaturregler ausgestattet, passen sie auf 37 ° C.
2. Waschen Sie die Azinuszellen in 30 ml Resuspensionsmedium und legen Sie sie in einem Glas oder Kunststoffrutsche. Hinweis: Wenn lipophile Farbstoffe verwendet werden, um Label für Plasmamembran mit lipophilen Farbstoffen markiert, färben die Acini für nicht mehr als 5 min auf die Kennzeichnung von internen Membranen, die durch Endozytose zu verhindern. Während der Arbeit, übernehmen die Acini vorsichtig und vermeiden Pipettieren.
3. Einmal am Mikroskop ist die Bild Acini, deren Morphologie klar, und Bildgebung von Acini die basolaterale Bläschen oder intrazelluläre Vakuolen Display zu vermeiden. Hinzufügen Sekretagogum tropfenweise oder mit Hilfe einer Perfusionskammer, entweder während oder unmittelbar vor dem Beginn der Bilderzeugung.
   Hinweis: Ein hoher Vergrößerung Objektive mit hoher numerischer Aperturen (zB × 63 / 1,4 × 100 oder / 1.4) wird empfohlen, subzellulärer Strukturen zu beobachten.

4. O / N Kultur Pankreasazini (Alternate Zellkulturtechnik)

HINWEIS: O / N Kultivierung wird oft für Adeno-Virus-Infektion eingesetzt. 16 h vor der Untersuchung - Infektion wird bei 10 ⁶ bis 10 ⁷ pfu / ml für 9 durchgeführt.

1. Kultur Pankreasazini für bis zu 20 Stunden. Aus einer einzigen Pankreas in 25 ml Kulturmedium (DMEM resuspendiert erhalten Acini mit fötalem Kälberserum (FCS) (5%), Natrium-Pyruvat (1%), Antibiotika (1%), L-Glutamin (0,5%), BSA ergänzt (10 mg / ml) und STI-(0,2 mg / ml), und geteilt zu fünf 10cm-Platten. infizieren die Acini mit Virus in einer Ebene 3 Bio-Sicherheitsschrank.
2. Inkubiert Pankreasazini bei 37 ° C in einer 5% CO ₂ befeuchtete Luft. Ermöglichen Acini in sauerstoffhaltigen Resuspensionsmedium 30 min zu erholen, bevor nachfolgende Untersuchung ^3,8.

Ergebnisse

Pankreasazini, die ordnungsgemäß isoliert wurden zeigen eine stereotypische Morphologie bei Durchlicht betrachtet. Ihre basolateralen Domänen sollten rund und frei von Blasen erscheinen. Die apikale Domäne wird von Hunderten von sekretorischen Vesikeln umgeben und erscheint dunkler in der Farbe (Abbildung 2a, b). Die Kerne sind basal an die Bläschenbereich. Zelltrümmer und Komponenten des Pankreasgangsystems und des endokrinen Pankreas, die in frühen Stadien der Acini Isolation (2C, D)

Diskussion

Neben der Ex-vivo-Kultur, alternative Setups für das Studium der exokrinen Sekretion gehören Intravitalmikroskopie und die Messung von Flüssigkeiten aus dem Pankreasgang. Intravitalmikroskopie wurde gezeigt, dass in der Maus Speicheldrüsen ¹⁰ gut bedienen. Dieses Verfahren kann die Sekretion in Echtzeit in dem intakten Tier aufnehmen, wird aber in der Auflösung und durch die Einrichtung zum Manipulieren des exokrinen Gewebe beschränkt. Beurteilung Sekretion durch Sammeln von Flüssigkeiten aus ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808