, Pankreatik acinar hücreleri ve salgı kapasitesinin değerlendirilmesi

Özet

İzole pankreas acininin in vivo morfolojisi ve etkinliğini muhafaza ve izleme ve salgılanmasını işlenmesi için güçlü yollar sunuyoruz. Bu çalışma acininin fare pankreasında izole edilebilir ve bunların salgı kapasiteleri ne değerlendirilebilir gösterilmiştir.

Özet

Pankreas asiner hücreler üretmek ve sindirim enzimleri salgılar. Bu hücreler ortak bir lümen oluşturur ve hisseleri bir küme olarak organize edilmektedir. Bu çalışma, bu hücrelerin izole edilmiş salgılama kapasitesi asini kültürü ile değerlendirilebilmektedir gösterilmiştir. Dokunulmamış ekzokrin pankreas birçok özelliklerini muhafaza izole acininin, manipüle ve tüm hayvanda daha kolay kontrol edilebilir, çünkü kurulum avantajlıdır. Ex vivo kültür asini in vivo doğayı temsil edecek şekilde pankreas asini şekilde tecrit önemli bir gerekliliktir. Protokol fare pankreas sağlam asinüsü izole etmek için nasıl gösterir. Daha sonra, pankreas salgısını değerlendirmek için iki yardımcı yöntem sunulmaktadır. Pankreas salgılarının doğrudan görüntüleme bir alt-hücresel çözünürlükte salgılanması karakterizasyonu sağlar ise amilaz salgılanması deneyi, küresel bir tedbir olarak hizmet vermektedir. Toplu olarak, bu teknikler presented burada ekzokrin salgısını incelemek için deneyler geniş bir yelpazede sağlar.

Giriş

Ekzokrin pankreas, memeli pankreas kütlesinin çoğunu oluşturur ve sindirim enzimleri ¹ üretimi ve salgılanması için adanmış. Ekzokrin pankreas, acinus, fonksiyonel birim ortak bir lümen oluşturur ve hisse epitel hücrelerinin bir küme. Hormonal veya nöronal uyarım üzerine, enzim ile dolu keseler bununla birlikte apikal hücre yüzeyine taşınan sigorta ve lümen içine ^1-3 içeriğini çıkarmak. Salgılanan enzimler daha sonra besin, besin parçalanmasını katalize ince bağırsağa kanalların bir birleştirme grubu tarafından drene edilir.

Bu video tüm pankreas izole edilir ve kendi salgılama kapasitesi ne kadar nasıl tespit edilebilir sağlam acininin gösterir. Bu kurulumu kullanılarak, pankreas salgı uyarılmasını takip yayımlanan amilaz nispi miktarının ölçülmesi ile ölçülür. Seçenek olarak ise, farklı salgılama kullanılmasıyla canlı görüntülenebilirsensörleri ve boyalar.

Sağlam pankreas birçok özelliklerini muhafaza izole acininin, manipüle edilen ve hayvanın tamamı ^4-6 daha kolay kontrol edilebilir yana pankreas asinüs ex vivo olarak ayar avantajlıdır. Bu kurulum aslında 1970 sonlarında geliştirilen ve bu tükrük ve meme bezlerinin ^3-7 gibi çeşitli ekzokrin dokuların çalışma için genişletilmiş beri oldu. Özellikle, bu polarize epitel kompleks hücresel kuruluşlara en az bir girişim ile salgılanmasının çalışma sağlar.

Protokol

NOT: hayvan denekleri Prosedürleri Weizmann Bilim Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Numune Hazırlama

1. Pankreas asinüs izolasyonu
   1. Başlamadan önce taze Krebs-Ringer bikarbonat HEPES (KRBH) ortam 300 ml hazırlayın. 140 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 1.16 karıştırın mM _MgCl2, 1 mM _CaCl2, 11 mM glikoz, 10 mM HEPES. Büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 0.1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü (STI) (yeniden süspansiyon ortamı) ekleyin. Orta kollagenazının (~ 0.75 mg / ml) (sindirim ortamı) ile takviye edilmiş 10 ml yeniden süspansiyon - 5 hazırlayın.
   2. ~ 30 dakika boyunca ortam KRB oksijenat. Köpüren önlemek için oksijenlenme sonra BSA ekleyin. 37 ° C resüspansiyon ve sindirim ortamlar getirin. NOT: orta Oksijenleyici hücre ölümlerini azaltır ve sekretagoglannın için yanıt geliştirir. Oksijenasyon etkisi en az 6 saat boyunca açıktır.
   3. kurumsal hayvan bakımı kurallarına göre, servikal dislokasyon veya CO ₂ boğulma fare Kurban. , Sırtında kurban hayvan koyun bir diseksiyon pad onu takın ve etanol ile karın yüzeyini temizleyin.
      NOT: kirlenmesini önlemek diseksiyon araçları ve kullanmadan önce KRBH ortamı için kullanılan suyun otoklavlamayın için. 0.2 um'lik bir filtreden filtre ortamı KRBH. Önce pankreas çıkarılması için% 70 etanol ile diseksiyon araçları yıkayın ve temiz bir bankta diseksiyonu yürütmek. Seviye 3 biyo-güvenlik kabini viral enfeksiyonların yürütmek. O / N kültür ortamına antibiyotik ekleyin (Bölüm 4'e bakınız).
2. Murin pankreas eksizyonu
   1. Kesi yaygın karın deri ve deri altı tabaka. Karaciğer, mide, bağırsak, pankreas ve dalak (Şekil 1) tanımlayın. NOT: Aşağıdaki adımlarda, yavaşça pankreas dokusu işlemek ve aşırı mekanik FORC uygulamaktan kaçınıne doku ve hücre ölümüne otomatik sindirim önler.
   2. İki künt forseps kullanarak, ince bağırsağa çekin. Mideden çıkışına yakın, ince barsak proksimal ucunda başlar. Bağırsaktan pankreas ayırın ve vücut boşluğunun içinde yerinde tutulması. Bir kez kalın bağırsağa ulaşan, pembe / beyaz bağ dokusu fark. Pankreas ile karıştırmayın.
   3. Yağ veya bağ dokusu toplama olmadan mümkün olduğunca pankreas dokusu temizleyin. Dalak ve mide ayrılmakta ve karın kan damarları altındaki (Şekil 1A-C) keserek pankreas kaldırmak.
      NOT: Tek bir hayvandan alınan pankreas asinüs verimi yüksek olduğu için, bir başka dokular oluşmasını önlemek için tüm pankreas dokusu toplama kaçınırsan.
3. Kolajenaz sindirimi
   1. Pankreas 37 ° C'ye kadar ısıtıldı yeniden süspansiyon ortamı içinde birkaç kez yıkayın ve pankreatik olmayan kalan bölümlerini kaldırmakdokular. Bir 20 mL sintilasyon şişesine önceden ısıtılmış bir sindirim ortamının ~ 5 ml pankreas bırakın. 1-3mm parçalarına pankreas kıyma. (Optimal olarak ~ 100 rpm çalkalama ile) ısıtılmış bir su banyosu içine koyun. Sindirim hızlandırmak için, sindirilmiş doku yukarı ve aşağı bir kez her birkaç dakikada bir pipetle.
      Not: kolajenaz sindirimi süresi esas olarak kolajenaz konsantrasyonu ve doku üzerinde uygulanan mekanik kuvvet miktarına bağlıdır. 30 hücre - 10 asinüs sonuçlanan 5 dak - 15 dakika boyunca, yaklaşık 0.75 mg / ml kollajenaz kullanımı ve 2 mm olan bir 5 ml'lik pipet ile polistiren doku pipetle her 3 orifis. Sindirme işlemini takiben, süspansiyon doku görülebilir parçadan oluşan bulanık görüntülenir. Kalogenazlar verimleri farklı ticari tip ve sayıda arasında değişir bu yana, ampirik sindirim zamanlamasını belirler.
   2. Yıkama ve filtreleme
      1. 50 ml'lik bir tüp içine sindirilmiş doku transferi ve kazı sonayeniden süspansiyon ortamı 45 ml ilave etmek suretiyle len. Bir kaba ile süspansiyon filtre (~ 1 mm), yeni bir tüpe, metal içine örgü. 3 dakika için akış yoluyla 100 × g santrifüj.
      2. Süpernatant atılır ve yeniden süspansiyona alma ortamı, 50 ml dijeste pankreas yeniden süspanse edildi. 70 veya 100 mikron naylon örgü ile süspansiyon filtre. Önceki gibi santrifüj.
      3. Resüspansiyon ortamın 5 ml -, yüzen, hasarlı asinüsü kaldırmak süpernatantı atmak ve 3 pankreas dokusu tekrar süspansiyon için. Yeniden süspansiyon ortamı 7 ml ile doldurulmuş 15 ml konik tüp içine pankreas asinüs 1 ml kısımlar uygulanır. 3 dakika - acininin 2 yerleşmek için izin verin. 1 ml'lik bir pipet ile tüpün dibine yerleştirilmiş olan asinüsü toplamak ve bu adımı tekrar 2 - 3 defa.
      4. Kendi durumunu test etmek için bir ışık veya diseksiyon mikroskobu altında pankreas asinüsü gör. Şekil 2'de, İlginç tasarım hücreleri üzerinde açtığı izolasyon saflığını ve zararları gözlemlemekng izolasyon. Kadar 20 saat boyunca bu hemen asinüsü veya kültür kullanın.

2. Amilaz Salgı Testi

Not: Amilaz salgılama tahlili pankreas asinüs salgılama kapasitesi için küresel bir ölçüsü olarak hizmet vermektedir. Bu genellikle ticari bir kit kullanılarak, pankreas acininin inkübe edildiği ortamın toplanması, ve ortamın amilaz aktivitesinin belirlenmesi suretiyle elde edilir.

1. Deneysel koşullar sayısının incelenecek belirlemek (örneğin, uyarılmamış genel uyarılmış). Her bir durum için en az üç suret kullanın. Buna ek olarak, ortam ("sıfır" örneği) amilaz aktivitesi için toplam hücresel amilaz içeriği (bakiyeleri örnek) ve bir kümesini belirlemek için replika kümesi ekleyin. Çok-çukurlu deney yapılacak olan plaka ve Her bir replika için mikro-tüpler iki takım etiketlemek kullanılır.
   NOT: 12 ya da 24 oyuklu plaka, sırasıyla, asinar süspansiyonlar 1 ve 0.5 ml izlemek için de kullanılabilir.
2. KRBH yeniden süspansiyon ortamı 30 ml iki kez asinüsü yıkayın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca yeniden süspansiyon ortamı içine inkübe edin. Çok-çukurlu plaka için uygun nihai konsantrasyona ulaşmak için bir 10 ul salgılattırıcısı damla ekleyin.
3. Pankreas acininin çift fazlı bir şekilde salgılattırıcısı gradyanı yanıt. Kolesistokinin (CCK) ve 1 uM'nin Karbakol'ün (Şekil 3A), 100 uM ⁵ - uygun salgılama değerleri ile konsantrasyonları 50 bulunmaktadır.
4. Yıkama ortamı içinde yeniden süspansiyon ve asinüsü tekrar süspansiyon. Acininin çok kuyucuklu plaka içine ve 'total' etiketli mikrotüpler içine süspansiyonun süspansiyon ve kısım eşit miktarlarda homojen olarak dağılmış olduğundan emin olun. 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. (Tercihen yumuşak çalkalama altında bir su banyosunda (~ 50 dak içinde)).
   NOT: asini tam sayısı experimen arasında değişebilirts her deneyde çoğaltır benzer olmalı ama. Bu nedenle, süspansiyonun tam acininin Alikotlama farklı tekrarlanmış ve koşullar arasında bir karşılaştırma için çok önemlidir.
5. İnkübasyon sırasında, "toplam" ve "sıfır" örneklerini üretmek. Santrifüj bakiyeleri 5000 x g 'de birkaç saniye mikrotüpler ve "zero' etiketli mikrotüpler içine süpernatandan 50 ul çıkarın ve 4 ° C' de koyun. Mikro-tüplerin Lyse Triton X-100 eklenmesi ile bakiyeleri örnekleri acininin% 1 bir son konsantrasyon elde etmek üzere. Kuvvetlice mikrotüpler vorteksleyin.
   NOT: 'Toplam' deney çoğaltır benzer çoğaltır eşit olarak dağıtılır. Asinüsü parçalayan amilaz toplam içeriğinin açığa çıkmasına yol açar. Seçenek olarak ise, her deney hücresel içeriğini belirlemek için, deneyin sonunda, her bir durumda ve parçalanmasıyla de asinüsü toplanır.
6. Asiner süspansiyon i en toplayınönceden etiketlenmiş mikrotüplerde ilk kümesi Nto. 5.000 × g birkaç saniye boyunca mikrotüpler santrifüj. Önceden etiketlenmiş mikrotüpler ikinci sette içine süpernatant aktarın.
7. Ticari bir kit ile amilaz aktivitesi için yüzer maddeler sınama. Salgılanan amilaz yüzdesini hesaplayın.
   NOT: Bu lineer aralığında amilaz aktivitesini okumak için çok önemlidir. Ilk toplam içeriğine salınan amilaz yüzdesi olarak salgılanan amilaz yüzdesini sunulması. Her bir üç kopya medyumuyla arka plan düzeyi amilaz çıkarma ve benzer başlangıç ​​normalize edilmiş bir toplam muhtevası bölün.

Pankreas Salgısının 3. Canlı Görüntüleme

Pankreas asinüs salgılama, canlı görüntüleme ile doğrudan izlenebilir. Çeşitli floresan boyalar ve sensörlerini kullanarak, canlı görüntüleme bir alt-hücresel çözünürlükte salgılanması karakterizasyonu sağlar.

1. Taze oksijenli resüspansiyon ortamı olarak hazırlayın in 1.1 adıma ve 37 ºC getirmek. Mikroskop ayarlayın ve bir sıcaklık kontrolörü ile donatılmış ise, 37 ºC ayarlayın.
2. Yeniden süspansiyon ortamı 30 ml asinar hücreleri yıkayın ve bir cam ya da plastik slayt yerleştirin. Not: lipofilik boyalar, lipofilik boyalarla işaretlenmiş plazma zarı için etiket endositoz ile iç membran etiketleme önlemek için en fazla 5 dakika boyunca asinüsü leke için kullanılacak ise. Çalışma boyunca yavaşça asinüsü işlemek ve aşırı pipetleme kaçının.
3. Mikroskop kez at, kimin morfoloji görüntü acininin açıktır ve taban kabarcıklar ya da hücre içi vakuoller görüntülemek asini görüntüleme kaçının. Halinde ya da sırasında veya hemen önce görüntüleme başlamadan, ya bir perfüzyon odasına kullanılarak salgı damla ekleyin.
   NOT: Yüksek sayısal delikler ile yüksek büyütme lensler (örneğin × 63 / 1.4 veya 100 / 1.4 ×) hücre içi yapıları gözlemlemek için tavsiye edilir.

4. O / Pankreas asini N Kültürü (Alternatif Hücre Kültürü Tekniği)

Not: O / N kültürlenmesi, genellikle adeno virüs enfeksiyonu için kullanılır. Tetkikten önce 16 saat - Enfeksiyon 9 10 ⁶ -10 ⁷ pfu / ml 'de gerçekleştirilir.

1. En fazla 20 saat boyunca kültür pankreatik acininin. 25 ml kültür ortamı (DMEM tek pankreasından elde edilen yeniden süspansiyon haline acininin fetal buzağı serumu (FCS) (% 5), sodyum-piruvat (1%), antibiyotikler (% 1), L-glutamin (% 0.5), BSA ile desteklenmiş (10 mg / ml) ve STI (0.2 mg / ml) ve 10 cm plakalar beş ayrılmıştır. seviye 3 biyo-güvenlik kabininde virüs ile asinüsü Infect.
2. % 5 _CO2 nemlendirilmiş hava içinde 37 ° C'de pankreas asinüsü kuluçkalanmıştır. Acininin sonraki inceleme ^3,8 önce 30 dakika boyunca ortam içinde yeniden süspansiyon haline oksijenli kurtarmak için izin verin.

Sonuçlar

Iletilen ışık ile bakıldığında düzgün izole edilmiştir Pankreas acininin klişeleşmiş bir morfolojiye sahiptir. Onların Bazolateral etki yuvarlak ve kabarcıkların yoksun görünmelidir. Apikal etki salgı veziküllerinde yüzlerce çevrili ve renk (Şekil 2A, B) koyu görünür. Çekirdekler veziküler alanına bazal yer almaktadır. Hücre kalıntısı ve pankreatik kanal sistemi ve acininin izolasyonu (Şekil 2C, D) erken aşamalarında tespit edilebilir endokrin pankre...

Tartışmalar

Ex vivo kültür Bunun yanı sıra, ekzokrin salgılanmasının çalışma için alternatif düzenleri pankreatik kanal sıvıların İntra vital mikroskopik ve hesaplanmasıdır. Intravital mikroskopi tükürük bezleri ¹⁰ fare iyi faaliyet gösterilmiştir. Bu yöntem, hayvanda, gerçek zamanlı olarak salgılanmasını kaydedebilir, ama çözünürlük ve ekzokrin doku işlenmesi için aracı ile sınırlıdır. Pankreatik kanala sıvıları toplayarak salgılanmasının değerlendirilmesi, aneste...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808