췌장 선포 세포의 분비 능력 평가

요약

고립 된 췌장 선포 세포는 생체 형태와 활동을 유지하고 모니터링 및 분비를 조작하기위한 강력한 방법을 제공합니다. 이 작업은 샘 꽈리가 마우스의 췌장으로부터 단리 할 수​​ 있고, 자신의 분비 능력이 어떻게 평가 될 수 있는지 보여준다.

초록

췌장 선포 세포 생산 및 소화 효소를 분비한다. 이 세포는 공동 루멘을 형성하고 주 클러스터로 구성됩니다. 이 작품은 이러한 세포의 분비 능력이 고립 꽈리의 문화에 의해 평가 될 수있는 방법을 보여줍니다. 그대로 외분비 췌장의 여러 특성을 유지 절연 꽈리는, 조작 및 전체 동물에서보다 더 용이하게 모니터링 할 수 있기 때문에 설치가 유리하다. 생체 문화가 꽈리의 생체 내 특성을 대표 할 수 있도록 췌장 선포 세포의 적절한 분리가 핵심 요구 사항이다. 이 프로토콜은 마우스의 췌장에서 그대로 선포 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 췌장 분비를 평가하는 두 개의 보완적인 방법이 제공됩니다. 췌장 분비 직접 이미징 서브 해상도 분비 세포의 특성화를 허용하면서 아밀라아제 분비 분석은, 글로벌 계수로서 기능한다. 종합적으로, 기술은 presen와여기 테드의 외분비 분비를 연구하기 위해 실험의 폭 넓은 스펙트럼을 할 수 있습니다.

서문

외분비 췌장은 포유 동물의 췌장의 질량의 대부분을 구성하고, 소화 효소 ^하나의 생산 및 분비에 전념하고 있습니다. 외분비 췌장, acinus의 기능 유닛은 공동 루멘을 형성하고, 주 상피 세포의 클러스터이다. 호르몬 또는 신경 자극되면, 효소로 가득 소포가 그것으로, 혀끝의 세포 표면에 퓨즈를 수송하고 루멘 ^1-3로 콘텐츠를 추방. 분비 된 효소는 그 때 영양소로 음식의 분해를 촉진 소장에 관의 유착 세트에 의해 배출된다.

이 동영상은 전체 췌장에서 고립되고, 자신의 분비 능력이 어떻게 평가 될 수있는 방법을 그대로 꽈리 보여줍니다. 이 설정을 사용하여, 췌장 분비를 자극 다음 출시 된 아밀라아제의 상대적인 양을 측정하여 정량화한다. 대안 적으로, 서로 다른 분비를 이용하여 묘화 될 수있는 라이브센서 및 염료.

본래 췌장의 여러 특성을 유지하는 절연 꽈리는, 조작 및 전체 동물 ^{4-6에서보다} 더 용이하게 모니터링 할 수 있기 때문에 췌장 선포 세포의 생체 외 설치가 유리하다. 이 설정은 원래 1970 년대 후반에 개발 및 타액 및 유선 ^3-7로 여러 외분비 조직의 연구를 위해 확장 된 이후였다. 특히, 이러한 편광 상피 세포의 복잡한 세포 조직에 최소한의 간섭 분비의 연구를 할 수 있습니다.

프로토콜

주 : 동물 대상으로 한 절차는 과학의 와이즈만 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1 샘플 준비

1. 췌장 선포 세포의 분리
   1. 시작하기 전에 신선한 크렙스 - 링거 중탄산 HEPES (KRBH) 매체의 300 ML를 준비합니다. 140 밀리미터의 NaCl, 4.7 밀리미터의 KCl을 혼합 1.16 mM의 _MgCl2를, 1 mM의 _{염화칼슘이,} 11 mM의 포도당, 10 mM의 HEPES. 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제 (STI) (재 부유 매체)를 추가한다. 매체 콜라게나 제 (~ 0.75 ㎎ / ㎖) (소화 매체)와 보충 재 부유 10 ㎖ - 5를 준비합니다.
   2. ~ 30 분 KRB 매체에 산소. 버블 링을 방지하기 위해 산소 후 BSA를 추가합니다. 37 ° C에서 재 부상 및 소화 매체를 가져와. 주 : 매체를 산소로하는 세포 사망률을 감소시키고 분비에 대한 응답 성을 향상시킨다. 산소의 효과는 최소한 6 시간 동안 명백하다.
   기관 동물 관리 지침에 따라, 자궁 경부 전위 또는 CO ₂ 질식하여 마우스를 희생. 그 뒷면에있는 희생 동물을 놓고 해부 패드에 연결하고 에탄올로 복부 표면을 청소합니다.
   참고 : 오염을 방지 절개 도구 및 사용 전에 KRBH 매체에 사용되는 물을 고압 증기 멸균하기 위하여. 0.2 μm의 필터를 통해 KRBH 매체를 필터링합니다. 이전에는 췌장 절제술로 70 % 에탄올로 해부 도구를 헹구고 깨끗한 벤치에 절개를 실시하고 있습니다. 레벨 3 생물 안전 캐비닛의 바이러스 감염을 수행하십시오. O / N 배양 배지에 항생제를 추가 (4 절 참조).
2. 쥐의 췌장 절제
   1. 절개 널리 복부 피부와 피하 층을 포함한다. 간, 위, 대장, 췌장, 비장 (그림 1) 확인합니다. 참고 : 다음 단계에서 조심스럽게 췌장 조직을 처리하고 과도한 기계적 그렇게해야을 적용하지 않도록전자 조직 및 세포 죽음의 자동 소화를 방지합니다.
   2. 이 무딘 집게를 사용하여 소장을 잡아 당깁니다. 위장으로부터 출구 근처 소장 근위 단부에서 시작. 소장에서 췌장을 분리하고 체강 내에서 유지됩니다. 일단 대장에 도달, 핑크 / 화이트 결합 조직을 알 수 있습니다. 췌장와 혼동하지 마십시오.
   3. 지방이나 결합 조직을 수집하지 않고 가능한 한 많은 췌장 조직을 취소합니다. 비장과 위장에서 그것을 분리 및 복부 혈관 그 아래 (그림 1A-C)를 절단하여 췌장을 제거합니다.
      NOTE : 단일 동물 췌장 선포 세포에서의 수율이 높기 때문에, 하나가 다른 조직을 수집하는 것을 방지하기 위해 모든 췌장 조직 수집을 삼가 할 수있다.
3. 콜라게나 소화
   1. 췌장 37 ° C로 가열 재 부상 매체에 몇 번 헹구고 비 췌장의 나머지 부분을 제거조직. 20 ml의 신틸레이션 바이알에 예열 된 소화 매체 ~ 5 ㎖ 중의 췌장 담가. 1-3밀리미터의 조각 췌장을 말하다. (최적 ~ 100 rpm으로 교반하면서) 가열 된 물을 욕조에 넣습니다. 소화를 촉진하기 위해, 소화 조직 상하마다 몇 분 피펫.
      NOTE : 콜라게나 제 소화 기간은 주로 콜라게나 제 농도 및 조직에 적용되는 기계적 힘의 크기에 의존한다. 30 셀 - (10)의 선포 세포의 결과로 5 분 - 약 15 분 동안 825 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제의 사용 및 2mm와 5 ㎖의 폴리스티렌 피펫 조직을 피펫 팅은 매 3 오리피스. 소화 후, 현탁액을 조직 보이는 조각을 포함 혼탁이 나타납니다. 콜라게나 효율 다른 상업적 유형과 많은 사이에서 변화하므로, 경험적으로 소화의시기를 결정한다.
   2. 세척 및 필터링
      1. 50 ML 튜브로 소화 조직을 전송하고 발굴을 종료재 부유 배지 45 ㎖에 첨가하여 estion. 거친 통해 서스펜션 필터 (~ 1mm) 금속은 새로운 튜브에 메쉬. 3 분 동안 흐름을 통해 100 × g에서 원심 분리기.
      2. 뜨는을 취소하고 재 부유 매체의 50 ㎖에 소화 췌장을 재현 탁. 70 또는 100 μm의 나일론 메쉬를 통해 현탁액을 필터링합니다. 이전과 원심 분리기.
      3. 재 부상 매체의 5 ML -, 부동, 손상 선포 세포를 제거 상층 액을 제거하고 3 췌장 조직을 재현 탁하기 위해. 재 부상 매체의 7 ML 가득 15 ML 원뿔 튜브에 췌장 선포 세포의 1 ml의 일부를 적용합니다. 3 분 - 꽈리 2 정착하도록 허용합니다. 1 ml의 피펫 튜브 바닥에 침전 한 선포 세포를 수집하고,이 단계 2를 반복 - 3 회.
      4. 자신의 상태를 테스트하기 위해 조명이나 해부 현미경으로 췌장 선포 세포를 볼 수 있습니다. 그림 2에서 두리 세포에 가해 분리의 순도와 손해 배상을 관찰NG 격리. 최대 20 시간 동안이 즉시 선포 세포 나 문화를 사용합니다.

2 아밀라아제 분비 분석

참고 : 아밀라아제 분비 분석은 췌장 선포 세포의 분비 능력에 대한 전역 조치로서 역할을한다. 이것은 보통 상업용 키트를 사용하여, 췌장 선포 세포가 배양 된 배지를 수집하고, 매체의 아밀라아제 활성을 결정함으로써 달성된다.

1. 실험 조건의 수를 결정하기 위해 검사한다 (예를 들어 비 - 자극 된 대는 자극). 각 조건에 대해 최소한 세 복제물을 사용합니다. 또한, 매체 (영점 샘플)의 아밀라아제 활성에 대한 전체 셀룰러 아밀라아제 함량 ( '전체'샘플)과 집합 결정에 복제 세트를 추가한다. 멀티 웰의 분석이 수행 될 것이다 플레이트 및 복제물 각 모세관의 두 세트를 사용하는 라벨된다.
   참고 : 12 또는 24 웰 플레이트S는 각각 선포 현탁액의 0.5 ml의 1을 모니터링하는데 사용될 수있다.
2. KRBH의 재 부상 매체의 30 ㎖에 두 번 선포 세포를 세척하고 37 ° C에서 30 분 동안 재 부상 매체에서 그들을 품어. 멀티 웰 플레이트에 적절한 최종 농도에 도달하는 분비 촉진제의 10μL 방울을 추가한다.
3. 췌장 선포 세포는 이중 phasic 방식으로 분비의 기울기에 반응한다. 콜레시스토키닌 (CCK)와 카르 바콜의 1μM (그림 3A)의 100 오후 ^5시 ​​- 최적의 분비 값이 농도는 50입니다.
4. 씻고 재 부상 매체에서 꽈리를 재현 탁. 꽈리가 멀티 웰 플레이트로하고 'total' 표지 마이크로 튜브로 현탁액의 서스펜션과 나누어 동일한 양으로 균일하게 분산되어 있는지 확인합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 접시를 품어. (바람직하게는 온화한 교반하면서 수조 (에 ~ 50 RPM)).
   참고 : 꽈리의 정확한 수는 experimen에 따라 다를 수 있습니다TS는 각 실험 내에서 반복 실험에서와 유사해야하지만. 따라서, 꽈리 현탁액의 정확한 aliquoting 다른 복제하고 조건 사이의 비교 중요합니다.
5. 배양하는 동안, '총'과 '제로'샘플을 생산하고 있습니다. 원심 분리기는 '총'5000 × g에서 몇 초 동안 마이크로 튜브 및 'zero' 표지 마이크로 튜브에 상층 액 50 μl를 제거하고 4 ° C에서 배치합니다. 를 Lyse는 모세관에 트리톤 X-100을 첨가함으로써 '전체'샘플 꽈리 1 %의 최종 농도에 도달한다. 적극적으로 마이크로 튜브를 흔든다.
   NOTE : '전체'이 실험의 반복 실험과 유사한 복제 Aliquote. 선포 세포를 용균, 총 아밀라아제 콘텐츠의 릴리스로 연결됩니다. 대안 적으로, 각각의 세포 복제에 콘텐츠를 결정하기 위해, 실험의 끝에, 각 조건에서 꽈리를 Lyse 수집.
6. 선포 서스펜션 난의 대부분을 수집미리 라벨링 모세관의 제 n을 세트. 5,000 × g에서 몇 초 동안 마이크로 튜브를 원심 분리기. 미리 라벨링 모세관의 두번째 세트로 뜨는을 전송합니다.
7. 상용 키트와 함께 아밀라제 활동에 대한 상층 액을 분석. 분비 된 아밀라아제의 비율을 계산합니다.
   주 : 선형 범위에서 아밀라아제 활성을 읽을 중요합니다. 초기 전체 내용에서 발표 아밀라아제의 비율로 분비되는 아밀라아제의 비율을 제시한다. 각 중으로부터 매체의 배경 아밀라아제 레벨 빼기와 마찬가지로 초기 정규화 된 총 함량으로 나눈다.

췌장 분비의 3 라이브 영상

췌장 선포 세포에서 분비 라이브 영상에 의해 직접 모니터링 할 수 있습니다. 다양한 형광 염료와 센서를 사용하여 라이브 영상은 세포 이하 해상도에서 분비의 특성을 수 있습니다.

1. 갓 산소 재 부상 매체로 준비 전n은 1.1 단계로 37 ºC에 가져다. 현미경을 설정하고 온도 조절 장치를 장착하는 경우, 37 ºC로 조정.
2. 재 부상 매체의 30 ㎖에 선포 세포를 씻고 유리 또는 플라스틱 슬라이드에 배치합니다. 주 : 친 유성 염료, 지용성 염료로 표지 원형질막 레이블 엔도 사이토 시스에 의해 막 내부 라벨을 방지하게는 5 분 이상 선포 세포를 염색하기 위해 사용되어야하는 경우. 작업 전반에 걸쳐 조심스럽게 선포 세포를 처리하고 과도한 피펫을 피하십시오.
3. 현미경에서 일단 그 형태 이미지 꽈리는 명확하고, 기저 기흉 또는 세포 내 액포를 표시 선포 세포의 이미징을 피하십시오. 현명 동안 또는 직전에 영상의 시작에 하나, 관류 챔버를 사용하여 분비 드롭을 추가합니다.
   참고 : 높은 숫자 조리개와 높은 배율 렌즈 (예 : × 63 / 1.4 또는 100 / 1.4 ×) 세포 내 구조를 관찰하는 것이 좋습니다.

4. O / 췌장 선포 세포의 N 문화 (대체 세포 배양 기술)

참고 : O / N 배양 자주 아데노 바이러스 감염에 사용됩니다. 검사 전 16 시간 - 감염 9 10 ⁶ -10 ⁷ PFU / ㎖에서 수행된다.

1. 최대 20 시간 동안 문화 췌장 선포 세포. 25 ml의 배지 (DMEM에서 단일 췌장으로부터 얻어지는 현탁 선포 세포는 우태 혈청 (FCS) (5 %), 나트륨 피루 베이트 (1 %), 항생제 (1 %), L-글루타민 (0.5 %), BSA로 보충 (10 ㎎ / ㎖) 및 STI (0.2 ㎎ / ㎖), 5 10cm 플레이트에 나누었다. 레벨 3 바이오 안전 캐비넷에 바이러스를 감염 꽈리.
2. 5 % CO _2의 가습 된 공기를 37 ℃에서 췌장 선포 세포를 배양 하였다. 꽈리 후속 시험 ^3,8하기 전에 30 분 동안 산소 재 부상 매체에 복구 할 수 있습니다.

결과

전송 된 빛에 의해 볼 때 제대로 분리 한 췌장 선포 세포는에 박힌 형태를 표시합니다. 이들의 기저 도메인은 라운드 기흉의 결여 나타납니다. 혀끝의 도메인이 분비 소포의 수백에 의해 둘러싸여 있으며, 색상 (그림 2A, B)에서 어두운 나타납니다. 핵 기공을 갖는 영역으로 기저에 위치하고 있습니다. 세포 파편 및 췌장 유관 시스템 및 선포 세포 분리 (도 2C, D)의 초기 단계...

토론

생체 문화 외에, 외분비 분비의 연구를위한 대안 설정은 췌관에서 유체의 intravital 현미경 및 측정을 포함한다. 의 intravital 현미경은 타액이 ¹⁰ 땀샘 마우스에서 잘 작동 것으로 나타났다. 이 방법은 그대로 동​​물에서 실시간으로 분비를 기록 할 수 있지만, 그것의 해상도와 외분비 조직을 조작하기위한 수단에 의해 제한된다. 췌관에서 유체를 수집하여 분비를 평가는 마취 된 쥐 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808