Évaluation de la capacité sécrétoire des cellules pancréatiques acineuses

Résumé

Acini pancréatiques isolés conservent leur morphologie et l'activité in vivo et offrent des moyens puissants pour surveiller et manipuler la sécrétion. Ce travail démontre comment acini peuvent être isolées à partir du pancréas de souris, et la façon dont les capacités de sécrétion peuvent être évaluées.

Résumé

Les cellules acineuses pancréatiques produisent et sécrètent des enzymes digestives. Ces cellules sont organisées en grappes qui forme et actions une lumière commune. Ce travail démontre comment la capacité de sécrétion de ces cellules peut être évalué par culture de acini isolé. La configuration est avantageuse car acini isolé, qui conservent de nombreuses caractéristiques du pancréas exocrine intact peut être manipulée et contrôlée plus facilement que chez l'animal entier. Une bonne isolation des acini pancréatiques est une condition essentielle pour que la culture ex vivo représentera la nature in vivo des acini. Le protocole démontre comment isoler acini intact par le pancréas de souris. Par la suite, deux méthodes complémentaires pour évaluer la sécrétion pancréatique sont présentés. Le dosage de la sécrétion d'amylase sert de mesure global, tandis que l'imagerie directe de la sécrétion pancréatique permet la caractérisation de sécrétion à une résolution de sous-cellulaire. Collectivement, les techniques PresenTed ici permet un large éventail d'expériences pour étudier la sécrétion exocrine.

Introduction

Le pancréas exocrine qui constitue la majeure partie de la masse du pancréas de mammifère et est dédié à la production et la sécrétion d'enzymes digestives ^1. L'unité fonctionnelle du pancréas exocrine, l'acinus, est un amas de cellules épithéliales qui forment et part une lumière commune. Lors de la stimulation hormonale ou des neurones, des vésicules remplies d'enzymes sont transportés à la surface apicale de la cellule, avec le fusible et expulser son contenu dans la lumière ^{de 1 à 3.} Les enzymes sécrétées sont ensuite drainés par un ensemble de conduits de coalescence dans l'intestin grêle, où elles catalysent la rupture de l'alimentation en substances nutritives.

Cette vidéo montre comment acini intacts sont isolés de l'ensemble du pancréas et de la façon dont leur capacité de sécrétion peut être évaluée. En utilisant cette configuration, la sécrétion pancréatique est quantifiée en mesurant la quantité relative de l'amylase qui a été publié après la stimulation. En variante, la sécrétion peut être visualisé en temps réel par l'utilisation de différentsdes capteurs et des colorants.

L'ex vivo configuration des acini pancréatiques est avantageuse car acini isolé, qui conservent de nombreuses caractéristiques du pancréas intacts, peut être manipulé et contrôlé plus facilement que chez l'animal entier ^4-6. Cette configuration a été développé à l'origine dans la fin des années 1970 et a depuis été étendu à l'étude de plusieurs tissus exocrines telles que la salive et les glandes mammaires ^3-7. Notamment, il permet l'étude de la sécrétion minimisant les interférences avec les organisations cellulaires complexes de ces épithéliums polarisés.

Protocole

REMARQUE: Les procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Institut Weizmann des Sciences.

Préparation de l'échantillon 1

1. Isolement des acini pancréatiques
   1. Préparer 300 ml de bicarbonate frais de Krebs-Ringer HEPES (KRBH) moyen avant de commencer. Mélanger 140 mM de NaCl, 4,7 mM KCl, 1,16 mM de _MgCl2, 1 mM de _CaCl2, glucose 11 mM, HEPES 10 mM. Ajouter de l'albumine de sérum bovin (BSA) et de l'inhibiteur de 0,1 mg / ml de trypsine de soja (STI) (milieu de remise en suspension). Préparation de 5 à 10 ml de milieu supplémenté remise en suspension avec de la collagénase (~ 0,75 mg / ml) (milieu de digestion).
   2. Oxygéner le milieu KRB pour ~ 30 min. Ajouter BSA après oxygénation pour empêcher un barbotage. Apportez remise en suspension et de digestion médiums à 37 ° C. NOTE: L'oxygénation du milieu réduit la mortalité cellulaire et améliore la réactivité de sécrétagogues. L'effet de l'oxygénation est apparente au moins pendant 6 heures.
   3. sacrifier la souris par dislocation cervicale ou CO ₂ asphyxie, selon les directives de protection des animaux. Placez l'animal sacrifié sur son dos, l'attacher à un tampon de dissection et nettoyer la surface abdominale avec de l'éthanol.
      REMARQUE: Pour éviter la contamination, l'autoclave les outils de dissection et l'eau utilisée pour les moyennes KRBH avant utilisation. Milieu filtrant KRBH à travers un filtre de 0,2 um. Avant l'excision du pancréas rincer les outils de dissection avec 70% d'éthanol et procéder à la dissection sur un banc propre. Effectuer des infections virales dans une armoire niveau 3 de biosécurité. Ajouter des antibiotiques pour le / milieu de culture N O (voir la section 4).
2. Excision du pancréas de souris
   1. Incision largement la peau de l'abdomen et de la couche sous-cutanée. Identifier le foie, l'estomac, l'intestin, du pancréas et de la rate (Figure 1). NOTE: Dans les étapes suivantes, la poignée de tissu pancréatique en douceur et éviter d'appliquer forc mécanique excessivee pour éviter l'auto-digestion de la mort de tissus et de cellules.
   2. En utilisant deux forceps émoussé, retirer l'intestin grêle. Commencer à la petite extrémité proximale intestin, près de la sortie de l'estomac. Séparer le pancréas et l'intestin de la retenir à l'intérieur de la cavité du corps. Une fois atteint le gros intestin, remarquer un tissu conjonctif rose / blanc. Ne pas confondre avec le pancréas.
   3. Effacer autant que possible le tissu pancréatique sans recueillir le tissu adipeux ou conjonctif. Retirer le pancréas en le détachant de la rate et l'estomac et coupant les vaisseaux sanguins abdominaux dessous (figure 1A-C).
      NOTE: Depuis le rendement de acini pancréatiques à partir d'un seul animal est élevé, on peut s'abstenir de collecter tous les tissus du pancréas, afin d'éviter la collecte d'autres tissus.
3. Digestion à la collagénase
   1. Rincer les pancréas à plusieurs reprises dans un milieu de remise en suspension chauffée à 37 ° C et enlever les parties restantes de non-pancréatiquetissus. Immerger dans le pancréas ~ 5 ml du milieu de digestion pré-chauffé dans un flacon à scintillation de 20 ml. Émincer le pancréas à des morceaux de 1-3 mm. Les placer dans un bain d'eau chauffé (de manière optimale sous une agitation de 100 rpm ~). Pour accélérer la digestion, la pipette vers le haut de tissu digéré et en bas une fois toutes les quelques minutes.
      REMARQUE: La durée de la digestion par la collagénase dépend principalement de la concentration de la collagénase et de la quantité de force mécanique appliquée sur le tissu. Utilisation de 0,75 mg / ml de collagénase pendant environ 15 min et le tissu de pipetage avec une pipette 5 ml de polystyrène avec un orifice de 2 mm tous les 3 - 5 min, ce qui entraîne des acini de 10 à 30 cellules. Après la digestion, la suspension semble trouble contenant des morceaux visibles de tissu. Depuis collagénases efficacité varie entre les différents types commerciaux et lots, de déterminer le moment de la digestion de manière empirique.
   2. Lavage et filtration
      1. Transférer le tissu digéré dans un tube de 50 ml et mettre fin à creuserestion en ajoutant 45 ml de milieu de remise en suspension. On filtre la suspension à travers un grossier (~ 1 mm) en maille métallique dans un tube frais. Centrifuger le accréditives à 100 g pendant 3 min.
      2. Jeter le surnageant et remise en suspension du pancréas digérés dans 50 ml de milieu de remise en suspension. On filtre la suspension à travers une maille de nylon 70 ou 100 um. Centrifugeuse comme avant.
      3. Afin d'éliminer flottante, acini endommagé, jeter le surnageant et remettre en suspension dans le tissu pancréatique 3 - 5 ml de milieu de remise en suspension. Appliquer 1 ml d'acini pancréatiques dans des tubes coniques de 15 ml remplis avec 7 ml d'un milieu de remise en suspension. Laisser le acini reposer pendant 2 - 3 min. Recueillir les acini qui se sont installés au fond du tube avec une pipette de 1 ml, et répétez cette étape 2 - 3 fois.
      4. Voir le acini pancréatiques sous un microscope optique ou dissection de tester leur condition. Dans la figure 2, observer la pureté de l'isolement et des dommages infligés aux cellules Duril'isolement ng. Utilisez ces acini immédiatement ou culture pour un maximum de 20 heures.

2. la sécrétion d'amylase Assay

NOTE: Le dosage de la sécrétion d'amylase sert de mesure globale de la capacité de sécrétion d'acini pancréatiques. Ce résultat est obtenu en collectant le milieu dans lequel le acini pancréatiques ont été incubées, et détermination de l'activité de l'amylase du milieu, habituellement en utilisant un kit commercial.

1. Déterminer le nombre de conditions expérimentales à examiner (par exemple par rapport à la non-stimulée stimulé). Utilisez au moins trois répétitions pour chaque condition. En outre, ajouter un ensemble de répétitions pour déterminer la teneur totale de l'amylase cellulaire (échantillon "total") et un ensemble pour l'activité de l'amylase du milieu (échantillon "zéro"). Attribuer une plaque multi-puits, dans lequel le dosage est effectué, et deux séries de micro-tubes pour chacune des répétitions à être utilisé.
   NOTE: 12 ou 24 puits plaques peut être utilisé pour surveiller 1 et 0,5 ml de suspension acineuses, respectivement.
2. Laver les acini deux fois dans 30 ml de milieu de remise en suspension KRBH et les incuber dans un milieu de remise en suspension pendant 30 min à 37 ° C. Pour la plaque multi-puits on ajoute une goutte de 10 ul de sécrétagogue d'atteindre la concentration finale appropriée.
3. Acini pancréatiques répondent à un gradient de sécrétagogue d'une manière bi-phasique. Les concentrations des valeurs optimales de sécrétion sont 50 - 100 pM de cholécystokinine (CCK) et 1 uM de carbachol (figure 3A) ^5.
4. Lavez et remettre en suspension les acini en milieu de remise en suspension. S'assurer que les acini sont répartis de manière homogène dans la suspension et aliquotes des quantités égales de suspension dans la plaque multi-puits et en les «microtubes de total' marqué. Incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 ° C. (De préférence dans un bain d'eau sous agitation modérée (environ 50 tours par minute)).
   REMARQUE: Le nombre exact de acini peut varier entre expérits mais devraient être semblables à répétitions dans chaque expérience. Ainsi, aliquotage précis de la suspension d'acini est critique pour la comparaison entre les différentes répliques et conditions.
5. Pendant l'incubation, de produire la «totale» et des échantillons «zéro». Centrifugeuse les microtubes «total» pour quelques secondes à 5000 × g et supprimer 50 pi à partir du surnageant en «microtubes zero' marqués et les placer à 4 ° C. Lyse des acini dans les échantillons «total» en ajoutant du Triton X-100 pour les microtubes pour atteindre une concentration finale de 1%. Vortex les microtubes vigoureusement.
   REMARQUE: Aliquoter la «totale» réplique similaire aux répétitions de l'expérience. Lyse acini, conduit à la libération de la teneur totale d'amylase. Sinon, recueillir les acini à chaque état et lyse à la fin de l'expérience, afin de déterminer le contenu cellulaire de chaque répétition.
6. Recueillir le plus de la suspension acinaire into le premier ensemble de microtubes pré-étiquetés. Centrifuger les microtubes de quelques secondes à 5000 x g. Transférer le surnageant dans le second ensemble de microtubes pré-étiquetés.
7. Doser le surnageant de l'activité de l'amylase avec un kit commercial. Calculer le pourcentage de l'amylase sécrétée.
   NOTE: Il est essentiel de lire l'activité de l'amylase à sa gamme linéaire. Présenter le pourcentage d'amylase sécrétée comme le pour cent de l'amylase libérée à partir de la teneur totale initiale. Soustraire le niveau du milieu de chaque triple fond de l'amylase et le diviser par le contenu total initial de même normalisée.

3. imagerie en direct de la sécrétion pancréatique

La sécrétion de acini pancréatiques peut être contrôlé directement par imagerie en temps réel. Utilisation de différents colorants fluorescents et des capteurs, l'imagerie en temps réel permet la caractérisation de sécrétion à une résolution de sous-cellulaire.

1. Préparer le milieu de remise en suspension fraîchement oxygéné comme in l'étape 1.1 et l'amener à 37 ° C. Réglez le microscope, et s'il est équipé d'un régulateur de température, ajuster à 37 ° C.
2. Laver les cellules acineuses dans 30 ml de milieu de remise en suspension et de les placer dans une lame de verre ou de plastique. Remarque: Si des colorants lipophiles doivent être utilisés pour étiqueter Pour membrane plasmique marqué avec des colorants lipophiles, tacher les acini pour pas plus de 5 minutes pour éviter l'étiquetage des membranes internes par endocytose. Tout au long de l'œuvre, gérer les acini en douceur et éviter pipetage excessive.
3. Une fois au microscope, l'image acini dont la morphologie est clair, et d'éviter l'imagerie de acini qui affichent des bulles basolatérales ou vacuoles intracellulaires. Ajouter goutte sécrétagogue sage ou à l'aide d'une chambre de perfusion, pendant ou immédiatement avant l'ouverture de l'imagerie.
   NOTE: A lentilles de zoom élevé avec des ouvertures numériques élevées (par exemple x 63 / 1,4 ou × 100 / 1.4) est recommandé d'observer les structures sous-cellulaires.

4. O / N culture de pancréas Acini (Culture Cellulaire Autre Technique)

REMARQUE: O / N culture est souvent utilisé pour l'infection par le virus adéno. L'infection est réalisée à 10 ⁶ -10 ⁷ pfu / ml pour 9 - 16 heures avant l'examen.

1. Culture acini pancréatiques jusqu'à 20 h. Acini remises en suspension obtenus à partir d'un seul pancréas dans 25 ml de milieu de culture (DMEM supplémenté avec du sérum de veau foetal (SVF) (5%), du sodium pyruvate (1%), les antibiotiques (1%), de L-glutamine (0,5%), BSA (10 mg / ml) et STI (0,2 mg / ml), et divisé à cinq plaques de 10 cm. Infect acini de virus dans une armoire de niveau de biosécurité 3.
2. Incubé à 37 ° C acini pancréatiques dans un air 5% de CO ₂ humidifiée. Autoriser les acini de récupérer dans un milieu de remise en suspension oxygéné pendant 30 min avant l'examen ultérieur ^{de 3,8.}

Résultats

Acini pancréatiques qui ont été correctement isolé afficher une morphologie stéréotypé lorsqu'il est vu par lumière transmise. Leurs domaines basolatérales doivent apparaître ronde et dépourvue de bulles. Le domaine apical est entouré par des centaines de vésicules de sécrétion et apparaît de couleur plus foncée (Figure 2A, B). Les noyaux gris centraux sont situés dans la région vésiculaire. Les débris cellulaires et les composants du système canalaire pancréatique et du pancr...

Discussion

En plus de la culture ex vivo, des configurations alternatives pour l'étude de la sécrétion exocrine comprennent microscopie intravitale et la mesure de fluides à partir du canal pancréatique. Microscopie intravitale a été montré pour bien fonctionner dans la souris glandes salivaires ^10. Cette méthode permet d'enregistrer en temps réel de la sécrétion dans l'animal intact, mais est limité dans sa résolution et des moyens pour manipuler le tissu exocrine. Évaluation de la s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808