Оценивая секреторную способность ацинарных клетках поджелудочной железы

Резюме

Изолированные поджелудочной ацинусы сохраняют свою морфологию в естественных условиях и активность и предложить эффективные способы для контроля и манипулирования секрецию. Эта работа показывает, как ацинусы может быть выделен из поджелудочной железы мыши, и как их секреторные возможности могут быть оценены.

Аннотация

Ацинарных клетках поджелудочной железы производят и выделяют пищеварительные ферменты. Эти клетки организованы в виде кластера, который формирует и акций совместного просвет. Эта работа показывает, как секреторную способность этих клеток можно оценить с помощью культуры изолированных ацинусов. Установка является предпочтительным, так как изолированные ацинусов, которые сохраняют многие характеристики интактной экзокринной поджелудочной железы можно манипулировать и контролировать легче, чем на животное в целом. Правильное выделение панкреатического ацинусов является ключевым требованием, чтобы экс естественных культура будет представлять природу в естественных условиях в ацинусов. Протокол показывает, как изолировать нетронутыми ацинусы из поджелудочной железы мыши. Впоследствии два взаимодополняющих методов оценки секреции поджелудочной железы представлены. Секреция амилазы анализ выступает в качестве глобального меры, в то время как прямая визуализация секреции поджелудочной железы позволяет характеризовать секреции в суб-клеточная резолюции. В совокупности эти методы изложеТед здесь включить широкий спектр экспериментов по изучению секреции экзокринную.

Введение

Экзокринной поджелудочной железы составляет большую часть массы поджелудочной железы млекопитающих и посвящен производству и секреции пищеварительных ферментов ^1. Функциональная единица экзокринной части поджелудочной железы, ацинуса, представляет собой кластер из эпителиальных клеток, который образует и акций совместного просвет. После гормональной стимуляции или нейронов, пузырьки, наполненные ферментами транспортируются к апикальной поверхности клетки, предохранитель с ним и удалить их содержание в просвет ^1-3. В секретируемые ферменты затем сливают на поглощающем множестве каналов в тонкую кишку, где они катализируют расщепление пищи в питательные вещества.

Это видео демонстрирует, как нетронутыми ацинусы изолированы от всей поджелудочной железы и как их секреторная способность можно оценить. Используя эту настройку, поджелудочной секреции количественно путем измерения относительного количества амилазы, который был выпущен после стимуляции. В качестве альтернативы, выделение могут быть отображены в прямом эфире использованием различныхдатчики и красители.

Экс естественных настройка поджелудочной ацинусов является предпочтительным, так как изолированные ацинусы, которые сохраняют многие характеристики интактных поджелудочной железы, можно манипулировать и контролировать легче, чем на животное в целом ^4-6. Эта установка была разработана в конце 1970-х и был так расширен для изучения нескольких экзокринных тканей, таких как слюнных и молочных желез ^3-7. Примечательно, что позволяет изучение секреции с минимальным вмешательством в сложных клеточных организациями этих поляризованных эпителия.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры, связанные животных предметы были утверждены уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в Институт Вейцмана по.

1 Подготовка образцов

1. Выделение панкреатического ацинусов
   1. Подготовьте 300 мл свежего бикарбоната Кребса-Рингера HEPES (KRBH) среде, прежде чем начать. Смешайте 140 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,16 _мМ MgCl2, 1 мМ CaCl _2, 11 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES. Добавить бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1 мг / мл соевого ингибитора трипсина (STI) (ресуспендирования среды). Подготовка 5 - 10 мл ресуспендирования среде, дополненной коллагеназы (~ 0,75 мг / мл) (переваривание среднего).
   2. Кислородом среду для KRB ~ 30 мин. Добавить BSA после оксигенации, чтобы предотвратить образование пузырьков. Принесите ресуспендированием и пищеварения сред до 37 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: кислородная среды снижает клеточную смертность и улучшает отзывчивость к секреции. Эффект оксигенации является очевидным, по крайней мере, в течение 6 часов.
   Жертвоприношение мыши путем смещения шейных позвонков или CO ₂ удушья, в соответствии с директивами институциональных по уходу за животными. Поместите жертвенного животного на спине, приложите его к рассечение площадку и очистить брюшную поверхность с этанолом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы избежать загрязнения, автоклав рассечение инструментов и воду, используемую для KRBH среды перед использованием. Фильтр KRBH среды через 0,2 мкм фильтр. До удаления поджелудочной железы промыть рассечение инструментов с 70% этанола и проводить рассечение на чистом столе. Провести вирусных инфекций в уровень 3 био-безопасности кабинета. Добавить антибиотики в O / N культивирования среды (раздел 4).
2. Удаление мышиного поджелудочной железы
   1. Разрез широко кожа живота и подкожной слой. Определите печени, желудка, кишечника, поджелудочной железы и селезенки (рисунок 1). ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих шагах, обрабатывать ткани поджелудочной железы осторожно и избегать применения чрезмерной механической ForcE, чтобы предотвратить автоматическое перевариванию ткани и гибели клеток.
   2. При использовании двух тупых щипцы, вытяните тонкий кишечник. Начало в тонкой кишке проксимального конца, рядом с выходом из желудка. Отдельные поджелудочную железу из кишечника и удерживать его внутри полости тела. После достижения в толстую кишку, заметили розовый / белый соединительную ткань. Не путайте его с поджелудочной железой.
   3. Очистите столько ткани поджелудочной железы, как это возможно без сбора жира или соединительной ткани. Снимите поджелудочную железу, отсоединив его от селезенки и желудка и резки брюшные сосуды под ней (1А-C).
      Примечание: Поскольку выход поджелудочной ацинусов от одного животного высока, можно отказаться от сбора всей ткани поджелудочной железы с целью предотвращения сбора других тканей.
3. Коллагеназой
   1. Промыть поджелудочной железы несколько раз в ресуспендирующего среде, нагретой до 37 ° С и удалить оставшиеся части непанкреатическоготканей. Погрузитесь поджелудочную железу в ~ 5 мл предварительно нагретой пищеварения среды в сцинтилляционный флакон 20 мл. Фарш поджелудочную железу на куски 1-3 мм. Поместите его в отапливаемом водяной бане (оптимально при перемешивании в ~ 100 оборотов в минуту). Для ускорения пищеварения, пипетки переваривается ткани вверх и вниз один раз в несколько минут.
      Примечание: продолжительность коллагеназой зависит в основном от концентрации коллагеназы и от количества механической силы, приложенной на ткани. Использование 0,75 мг / мл коллагеназы в течение примерно 15 мин и пипеткой ткани с 5 мл пипетки полистирола с 2 мм отверстие, через каждые 3 - 5 мин, в результате чего ацинусов 10 - 30 клеток. После расщепления, подвеска кажется мутной, содержащий видимые кусочки ткани. С коллагеназы эффективность варьируется у разных коммерческих видов и большим, определить время пищеварения эмпирически.
   2. Стиральная и фильтрация
      1. Передача переваренной ткани в 50 мл пробирку и прекратить рытьestion добавлением 45 мл ресуспендирования среды. Суспензию фильтруют через грубую (~ 1 мм) металлической сетки в свежую пробирку. Центрифуга проточного при 100 × г в течение 3 мин.
      2. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют переваренных поджелудочной железы в 50 мл среды ресуспендирования. Суспензию фильтруют через нейлоновую сетку 70 или 100 мкм. Центрифуга, как и раньше.
      3. Для того чтобы удалить плавающий, поврежденный ацинусы, отбросить супернатант и ресуспендируют ткани поджелудочной железы в 3 - 5 мл ресуспендирующего среды. Применение 1 мл порции ацинусов поджелудочной железы в 15 мл конические пробирки, наполненные 7 мл ресуспендирования среды. Разрешить ацинусы согласиться на 2 - 3 мин. Соберите ацинусы которые поселились в нижней части трубки с 1 мл пипетки, и повторить этот шаг 2 - 3 раза.
      4. Просмотр поджелудочной ацинусы под световым или рассекает микроскопом, чтобы проверить их состояние. На рисунке 2, наблюдать чистоту изоляции и повреждения, нанесенного клеток Дуриизоляция нг. Используйте эти ацинусы немедленно или культуру до 20 часов.

2 Амилаза секреция Анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: секреция амилазы анализ выступает в качестве глобального меры для секреторной способности поджелудочной ацинусов. Это достигается путем сбора среды, в которой поджелудочной ацинусы инкубировали, и определение активности амилазы в среде, как правило, с помощью коммерческого набора.

1. Определить количество экспериментальных условиях должны быть рассмотрены (например, не стимулировали против стимулировали). Использование по меньшей мере, трех повторов для каждого условия. Кроме того, добавить набор реплик, чтобы определить общее клеточное содержание амилазы ('Общее' образца) и набор для активности амилазы среды («ноль» образца). Этикетка мульти-луночного планшета с, в которых анализ будет проводиться, и два набора микропробирок для каждого из репликантов, которые будут использоваться.
   Примечание: 12 или 24-луночный планшетс может быть использован для контроля 1 и 0,5 мл ацинарных суспензий, соответственно.
2. Промыть ацинусы два раза в 30 мл среды KRBH ресуспендирования и инкубируют их в ресуспендирования среды в течение 30 мин при 37 ° С. Для пластины с несколькими также добавить каплю 10 мкл секрецию, чтобы достичь соответствующего конечной концентрации.
3. Поджелудочной железы ацинусы отвечать на градиентом секрецию в двухфазной форме. Концентрации с оптимальными значениями секреции являются 50 - 100 мкм холецистокинина (CCK) и 1 мкМ карбахола (Рисунок 3А) ^5.
4. Вымойте и ресуспендируют ацинусы в ресуспендирующего среды. Убедитесь, что ацинусы распределены однородно в подвески и аликвотные равных количеств суспензии в мульти-луночного планшета в и в 'total' меченных микропробирок. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С. (Предпочтительно на водяной бане при умеренном перемешивании (~ 50 мин)).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точное количество ацинусов может варьироваться от экспериментальTS, но должны быть одинаковыми по повторах в пределах каждого эксперимента. Таким образом, точная аликвоты из ацинусов подвески имеет решающее значение для сравнения различных повторах и условий.
5. Во время инкубации, производить 'общей' и 'Zero' образцы. Центрифуга "Всего" пробирки для несколько секунд в 5000 × г и удалить 50 мкл из супернатанта в «zero'-меченых микропробирок и разместить их на 4 ° С. Lyse ацинусы в «Итого» образцов, добавив Triton X-100 для микропробирок достичь конечной концентрации 1%. Vortex микропробирки энергично.
   Примечание: Aliquote 'общее' повторяет похожи на повторов эксперимента. Лизированием ацинусы, приводит к высвобождению от общего содержания амилазы. Кроме того, собирать ацинусы при каждом условии и лизировать в конце эксперимента, чтобы определить клеточное содержание каждой повторности.
6. Собрать большую часть ацинарных подвески INto первого набора предварительно меченных микропробирок. Центрифуга микропробирок на несколько секунд в 5000 × г. Передача супернатант во второй набор предварительно меченных микропробирок.
7. Анализе супернатанта для активности амилазы с коммерческого набора. Вычислить процент амилазы секретируемый.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы прочитать активности амилазы в его линейном диапазоне. Представьте процент амилазы секретируемый как процент амилазы, высвобождаемого из первоначального общего содержания. Вычтите уровень фона амилазы среды от каждого трех экземплярах и разделите его на аналогично нормированной начальной общего содержания.

3 Живая съемка секрецию поджелудочной железы

Секреция поджелудочной ацинусов может контролироваться непосредственно живого изображения. Используя различные флуоресцентные красители и датчики, живая изображений позволяет характеризовать секреции на субклеточном резолюции.

1. Подготовьте недавно кислородом ресуспендирования среду, как ян шаг 1,1 и довести его до 37 ° С. Установите микроскоп, и если они оснащены регулятором температуры, настроить его на 37 ° С.
2. Вымойте ацинарные клетки в 30 мл ресуспендирующего среды и поместить их в стеклянную или пластиковую слайде. Примечание: Если липофильные красители должны использоваться для обозначения Для плазменной мембране, помеченный липофильных красителей, испачкать ацинусы не более чем на 5 мин, чтобы предотвратить маркировку внутренних мембран эндоцитозом. На протяжении работы, обрабатывать ацинусы мягко и избежать чрезмерного пипетирование.
3. После того, как в микроскоп, ацинусы изображение которого морфология ясно, и избежать визуализации ацинусов которые должны показываться в базолатеральных волдыри или внутриклеточные вакуоли. Добавить каплю секрецию мудрым или с помощью перфузии камеры, во время или непосредственно перед началом съемки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: большом увеличении линзы с высоким числовых отверстий (например × 63 / 1,4 или × 100 / 1,4) рекомендуется соблюдать субклеточные структуры.

4. O / N Культура поджелудочной ацинусов (Alternate Культура клеток Техника)

Примечание: O / N культивирование часто используется для аденовирус-инфекции. Заражение осуществляется на 10 ⁶ -10 ⁷ БОЕ / мл в течение 9 - 16 часов, после чего экспертизы.

1. Культура поджелудочной ацинусы до 20 часов. Ресуспендированные ацинусов, полученные из одного поджелудочной железы в 25 мл культуральной среды (DMEM, дополненной фетальной телячьей сыворотки (FCS) (5%), натрий-пирувата (1%), антибиотики (1%), L-глютамин (0,5%), BSA (10 мг / мл) и STI (0,2 мг / мл), и делится на пять 10см пластин. заразить ацинусы с вирусом в уровень 3 био-безопасности кабинета.
2. Инкубировали поджелудочной ацинусы в 37 ° в 5% CO ₂ увлажненном воздухе. Разрешить ацинусы восстанавливаться в среде кислородом ресуспендирования в течение 30 мин перед последующей экспертизы ^3,8.

Результаты

Рак поджелудочной ацинусы, которые были изолированы правильно показать стереотипное морфологию, если смотреть в проходящем свете. Их базолатеральных домены должны появиться круглые и лишенный пузырьков. Верхушечный домен в окружении сотен секреторных везикул и кажется более темным ...

Обсуждение

Кроме того, экс естественных культуры, альтернативные установки для изучения экзокринной секреции включают прижизненный микроскопии и измерения жидкостей из поджелудочной железы. Прижизненные микроскопии было показано, что хорошо работает в слюнных желез мыши ^10. Этот мет?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808