استخدام الميكروسكيل السيليكون الكابولي لتقييم مقلص الخلوية وظيفة<em&gt; في المختبر</em

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام الكابولي السيليكون الميكروسكيل والأسطح الثقافة طيعة لقياس انقباض خلايا العضلات في المختبر. انكماش الخلوي يسبب الانحناء ناتئ، والتي يمكن قياسها، وسجلت، وتحويلها إلى قراءات للقوة، وتوفير نظام غير الغازية وقابلة للقياس وظيفة مقلص في المختبر.

Abstract

ويعتمد تطوير في المختبر فحوصات أكثر التنبؤية ذات الصلة وبيولوجيا على النهوض أنظمة زراعة الخلايا تنوعا التي تسهل عملية التقييم الوظيفي للخلايا المصنفة. تحقيقا لهذه الغاية، والتكنولوجيا ناتئ الميكروسكيل تقدم منصة التي لقياس وظيفة مقلص من مجموعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الهيكل العظمي والقلب، وخلايا العضلات الملساء، من خلال تقييم الانكماش الناجم الركيزة الانحناء. تطبيق صفائف ناتئ المضاعفة يوفر وسيلة لتطوير بروتوكولات معتدلة إلى عالية الإنتاجية لتقييم نجاعة الأدوية وسمية، النمط الظاهري المرض والتقدم، وكذلك العصبية والعضلية وغيرها من خلية خلية التفاعلات. توفر هذه المخطوطة التفاصيل لافتعال صفائف ناتئ موثوقة لهذا الغرض، والأساليب المطلوبة لخلايا بنجاح الثقافة على هذه السطوح. ويرد وصف إضافي بشأن الخطوات اللازمة لأداء وظيفي الشرجysis من أنواع الخلايا مقلص الحفاظ على مثل هذه المصفوفات باستخدام الليزر الرواية ونظام الصور كاشف. البيانات المقدمة تمثيلية يسلط الضوء على الدقة وطبيعة استنساخه من تحليل وظيفة مقلص ممكنة باستخدام هذا النظام، فضلا عن مجموعة واسعة من الدراسات التي يمكن تطبيق هذه التكنولوجيا. اعتماد واسع النطاق الناجح لهذا النظام يمكن أن توفر المحققين مع وسائل لأداء والدراسات الوظيفية السريعة منخفضة التكلفة في المختبر، مما يؤدي إلى توقعات أكثر دقة لأداء الأنسجة، تطور المرض والاستجابة للعلاج علاجية جديدة.

Introduction

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades^1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro^3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option^6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models¹¹.

Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells^12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology¹⁴, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection¹⁵. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies^15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.

This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. الكابولي تصنيع رقاقة

وقدمت تفاصيل مصورة من الخطوات تلفيق مبين في الشكل 1.

1. وضع السيليكون على العازل (SOI) الرقائق في الفرن وتخبز على 125 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إلى يذوى منهم.
2. إيداع 1.5 ميكرون طبقة سميكة من أكسيد السليكون على طبقة مقبض رقاقة SOI المجففة باستخدام البلازما تعزيز ترسيب الأبخرة الكيميائية (PECVD) الأداة.
3. وضع رقاقة على تشوك تدور المغطي مع طبقة جهاز مواجهة. ضمان يتركز رقاقة، الاستغناء 2 مل من P20 التمهيدي في وسط الرقاقة، وتدور بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية. P20 التمهيدي يعزز التصاق مقاوم الضوء على طبقة الجهاز.
4. بينما الرقاقة لا يزال على تدور المغطي تشاك، الاستغناء 2 مل من S1818 مقاوم الضوء في وسط الرقاقة، وتدور بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية إلى سbtain 1.5 ميكرون طبقة سميكة من مقاوم الضوء.
5. وضع رقاقة على طبق ساخن وإجراء خبز لينة في 115 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
6. إجراء الصعب التعرض للأشعة فوق البنفسجية الاتصال باستخدام ضوئيه اتصال قناع اليجنر من أجل نقل نمط من قناع ناتئ إلى مقاوم الضوء على طبقة الجهاز. حساب زمن التعرض على أساس قيمة الطاقة تعرض 125 ميغا جول / سم ² لS1818 مقاومة للضوء.
7. تطوير مقاومة للضوء عن طريق غمر الرقاقة في 726 MIF مقاومة للضوء المطور لمدة 1 دقيقة في حين تهز بلطف الرقاقة ذهابا وإيابا.
8. شطف الرقاقة مع دي المتأينة (DI) المياه وجففه، ويفضل استخدام أداة مجفف تدور شطف (SRD).
9. إزالة مقاوم الضوء من حافة الرقاقة (حتى 5 مم من الحافة) باستخدام قطعة من القطن مغموسة في الأسيتون.
10. تحميل الرقاقة في أعماق رد الفعل ايون إحفر (DRIE) أداة، مع الجانب مقاوم الضوء مواجها لها، وتشغيل وصفة لحفر طبقة السيليكون نمط من خلال ديفيطبقة م. وظائف طبقة أكسيد دفن كما توقف حفر، بحيث تؤدي إلى حفر مع 50٪ إلى 100٪ أكثر من دورات ومن المتوقع أن تكون ضرورية لضمان حفر كاملة.
11. وضع رقاقة في حل حمام مقاوم الضوء الساخن لمدة 20 دقيقة لتجريد مقاومة للضوء. نقل الرقاقة إلى السريع تفريغ الشطاف (QDR) لشطف الرقاقة بالماء DI. بعد الشريط ضوء، تحميل الرقاقة في أداة SRD لشطف وتجفيف رقاقة. تفقد الرقاقة تحت المجهر لضمان ظهور نمط ناتئ كما هو متوقع.
12. إيداع 1 ميكرون طبقة سميكة من أكسيد السيليكون مخدر الامم المتحدة على طبقة من جهاز الرقاقة باستخدام أداة PECVD. وظائف هذه الطبقة أكسيد كطبقة واقية للالكابولي خلال مزيد من خطوات المعالجة.
13. وضع رقاقة على تشوك تدور المغطي مع طبقة مقبض مواجهة لبدء معالجة الجانب الخلفي من الرقاقة. ويتركز ضمان يفر، الاستغناء 2 مل من P20 التمهيدي في وسط الرقاقة، وتدور بسرعة 3،000 دورة في الدقيقةلمدة 60 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية.
14. بينما الرقاقة لا يزال على تدور المغطي تشاك، الاستغناء 2 مل من SPR220-4.5 مقاوم الضوء على مركز الرقاقة، وتدور بسرعة 2000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية للحصول على 6.5 ميكرون طبقة سميكة من مقاومة للضوء.
15. وضع رقاقة على لوحة القرب الساخنة لإجراء خبز لينة في 115 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
16. باستخدام اتصال اليجنر ضوئيه قادرة على الجبهة / محاذاة إلى الوراء، محاذاة قناع نافذة المؤخر إلى الجانب الأمامي نمط ناتئ وإجراء اتصال الصعب التعرض للأشعة فوق البنفسجية من أجل نقل نمط من قناع نافذة المؤخر لمقاوم الضوء على طبقة المقبض. استخدام وقت التعرض محسوبة على أساس قيمة الطاقة تعرض 480 ميغا جول / سم ² لSPR220-4.5 مقاومة للضوء.
17. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، دعونا لا تزال رقائق في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة قبل الخطوة تجهيز المقبلة.
18. تطوير مقاومة للضوء عن طريق غمر الرقاقة فيمطور 726 MIF مقاومة للضوء لمدة 2 دقيقة في حين تهز بلطف الرقاقة ذهابا وإيابا.
19. شطف الرقاقة مع دي المتأينة (DI) المياه وجففه، ويفضل استخدام أداة مجفف تدور شطف (SRD).
20. وضع الرقائق في الفرن على 90 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
21. حفر طبقة أكسيد السيليكون على مساعدات من الرقاقة باستخدام نظام ري مع الغازات المفلورة وصفة لأكسيد الحفر. أكسيد نقوش على مساعدات من الرقاقة بمثابة قناع حفر لمزيد من المعالجة. تفقد رقائق تحت المجهر للتأكد من أن أكسيد السيليكون في الإطار يتعرض هو محفورا تماما.
22. إزالة مقاوم الضوء على حافة الرقاقة (حتى 5 مم من الحافة) باستخدام مسحة غرفة نظيفة مغموسة في الأسيتون.
23. تحميل الرقاقة في أداة DRIE مع وتشغيل وصفة لحفر طبقة نمط مقبض على عمق 500 ميكرون مع دفن عمل طبقة أكسيد كما توقف حفر. تقسيم هذا حفر في أشواط متعددة لمنع التدفئة المفرطة للويفر، الذي يسبب النقش يتعارض من السيليكون. هذه الخطوة حفر يزيل تماما السيليكون تحت الكابولي.
24. إجراء خطوة الحفر الرطب باستخدام 25٪ مخفف HF منمش، لتجريد طبقة أكسيد دفن تحت الكابولي وطبقة واقية أكسيد على أعلى من الكابولي.
    ملاحظة: هذه الخطوة النشرات السطح السفلي من الكابولي السيليكون ويفتح نافذة تحت لتوفير الوصول إلى سبر ناتئ مع الليزر أيضا.
25. شطف الرقاقة باستخدام سلسلة من حمامات المياه DI والجافة بعناية مع النيتروجين. منذ يتم دعم الكابولي فقط في قواعدهم، لا تستخدم البخاخات قوية من المياه DI أو غاز خامل مباشرة على الكابولي.
26. يلتصق رقائق الفردية من الرقاقة على غرار يلتصق تنتج أثناء الخطوة مقبض طبقة حفر.

الثقافة 2. خلية

1. إعداد 13F coverslips وفقا للأساليب المنشورة سابقا ^17.
   ملاحظة: إذا 13F كوفrslips غير متوفرة، أي سطح مسعور مع زاوية الاتصال فوق 95 درجة يمكن استخدامها.
2. تعقيم رقائق ناتئ و13F coverslips في محلول الإيثانول 70٪ والسماح للهواء الجاف في غطاء تدفق.
3. وضع رقائق ناتئ الفردية على رأس 13F coverslips داخل القياسية 12 لوحة جيدا.
4. معطف الكابولي مع البوليمر الحيوي أو تعديل سطح الأمثل لنوع من الخلايا المستخدمة وفقا لبروتوكولات الثقافة الخلية القياسية.
5. إعادة تعليق الخلايا في المتوسط ​​من نمو محددة إلى التركيز المطلوب.
   ملاحظة: هذا البروتوكول ينتج عنه عدد كبير من الخلايا التي تقع من خلال النافذة ناتئ وعدم التزامها سطح ناتئ المطلوب. ولذلك ينبغي الاستعدادات خلية 3-4x أكثر تركيزا من الاستعدادات لساترة القياسية. على سبيل المثال، عادة ما يتم تنفيذ البذر الخلايا الأقمار الصناعية الفئران العضلات والهيكل العظمي من استخدام كثافة البذر من 500-700 خلية / ملم مربع ^15،16، وتستخدم مع ركائز ناتئ في 2،000 خلية / ملم مربع. ينبغي إجراء تجارب الأمثل للخروج مع مصادر خلية جديدة للتأكد من كثافة البذر المناسبة.
6. ماصة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية على سطح رقاقة ناتئ، وضمان فقاعة متوسطة تغطي النوافذ ناتئ تماما. إذا كان الفتائل المتوسطة من خلال النافذة ولا تشكل فقاعة ثابتة على رأس الكابولي استبدال ساترة 13F وreattempt الطلاء.
7. نقل لوحة تحتوي على رقائق إلى حاضنة والسماح للخلايا الالتزام لمدة 1 ساعة على الأقل (يفضل 2-3 ساعة).
8. بعد هذه الفترة والطلاء، واستخدام ملقط معقم لنقل الشريحة إلى بئر نظيفة، دون ساترة 13F، وأعلى حتى الثقافة مع 1 مل من وسط النمو.
9. العودة إلى لوحة الحاضنة.
10. الحفاظ على خلايا وفقا لبروتوكول بهم القياسية للصيانة في المختبر coverslips على. لخلايا عضلات الهيكل العظمي،تبديل التركيب المتوسط ​​للحث على تشكيل myotube مرة واحدة سوف تصبح خلايا متكدسة يكون ضروريا.

3. الإعداد من الأجهزة والبرامج لتحليل الكابولي الإمالة

1. وضع صحن الثقافة ساخنة في مرحلة مجهر تستقيم الكهربية.
2. إضافة 3 مل من المتوسط ​​التغذية وعلقت الخلايا حاليا في (+ 10 ملي HEPES) إلى مرحلة المجهر ساخنة.
3. جبل الأقطاب الفولاذ المقاوم للصدأ من الداخل من صحن الثقافة ساخنة على مسافة فصل 15 ملم وربطها مولد النبض، قادرة على إنتاج البقول التحفيز مجال متفاوتة الشدة، والتردد، والموجي، للسماح للنظام التحفيز لإنتاج الحقل الخلايا عند الاقتضاء.
4. الترباس ليزر الهليوم النيون، التي شنت على مراحل XY متعدية، على الجانب السفلي من الجدول المجهر وتعديله بحيث يتم توجيه شعاع الليزر من خلال قاعدة الطبق الثقافة ساخنة في اقاربهم 30 ° زاويةالبريد إلى الطائرة من ناتئ.
5. ينشق وحدة نمطية الصور كاشف رباعي، التي شنت على مراحل XY متعدية، على الجانب السفلي للمرحلة المجهر وضبط الموقف بحيث ينعكس شعاع الليزر الأراضي في وسط ال 4 أجزاء. الشكل 2 لمحة عامة عن الأجهزة التي أنشئت اللازمة لتنفيذ بروتوكول صفها.
6. كتابة برنامج برنامج للتحكم في المحركات الخطية التي تفحص عبر الكابولي. كتابة برنامج حاسوبي مع الإشارة إلى الرسم البياني الوارد في الشكل 3. يتم توفير واجهة رسومية برمجتها للاستخدام مع هذا النظام في الشكل 4.

4. تسجيل الكابولي انحراف البيانات

1. تشغيل أجهزة تحليل ناتئ والبرمجيات المرتبطة بها.
2. إدراج المرحلة الثرمستور ساخنة في الوسط وانتظر لقراءة 37 درجة مئوية.
3. تضاف شرائح ناتئ إلى مرحلة مع cantileveRS موجهة نحو الجانب الأيمن من المسرح.
4. بدوره على مصدر ضوء المجهر.
5. التركيز المجهر لجعل حواف الكابولي في طريقة العرض واستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف لوضع شعاع الليزر على طرف ناتئ 1. ملاحظة: إذا افترضنا أن الكابولي موجهة إلى يمين المسرح، ناتئ 1 هو واحد المتمركزة في أعلى يسار مجموعة وأرقام الجري إلى 16 في الجزء السفلي الأيسر. 17 ناتئ هو في المكان المناسب العلوي ويمتد إلى 32 في أسفل اليمين (الشكل 5A).
6. اضغط على "اللعب" على برنامج تسجيل.
7. ضع الصور كاشف بحيث يقرأ إشارة "0" في كل من س و ص إطارات من خلال تعديل المحركات السائر التحكم في الصور كاشف.
8. تحديد موقف ناتئ 1 في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف (الشكل 4).
9. نقل الليزر لطرف ناتئ 16، كرر الخطوة 4.7، ووضع cantilevإيه 16 وظيفة في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
10. نقل الليزر لطرف ناتئ 32، كرر الخطوة 4.7، ووضع ناتئ 32 موقف في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
11. نقل الليزر لطرف ناتئ 17، كرر الخطوة 4.7، ووضع ناتئ 17 موقف في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
12. إيقاف مصدر ضوء المجهر وضوء النفقات العامة في المختبر.
13. اضغط على "سجل" على برنامج تسجيل.
14. تعيين الأجهزة مولد النبض إلى 40 ميللي ثانية، 5 V البقول على تردد 1 هرتز، وتحويل الجهاز على.
    ملاحظة: اختياريا، وتوظيف بروتوكولات التحفيز الأمثل لمصادر معينة من الخلايا في هذه المرحلة، إعدادات المعلنة المبادئ التوجيهية استنادا إلى البيانات التي تم جمعها باستخدام مصادر بشرية وخلية القوارض ^{12،13،15،16.}
15. باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف، تعيين الأجهزة لمسح عبر مجموعة 32 ناتئ، ووقف لمدة 5 ثانية في كل يومه.
16. عند الفحص من 32 الكابولي كاملة، إيقاف المنبه، ثم وقف برنامج تسجيل وطرح ملف البيانات.
17. دراسة أثر المسجلة من كل ناتئ عن أدلة على النشاط مقلص. تقديم مذكرة من كل ناتئ بردود فعل إيجابية. يتم تعريف الانكماش بمثابة الذروة إذا كان الانحراف هو 0.1 V على الأقل فوق خط الأساس.
18. إزالة أي الكابولي عدم استجابة من بروتوكول المسح على برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
19. ويمكن بعد ذلك إعادة فحص والكابولي النشطة دون التحفيز من أجل الحصول على قراءة من النشاط العفوي مقلص الخلية.
20. تشغيل المسح الضوئي مع أو بدون التحفيز الكهربائي مجال واسع، بعد إضافة مركب العلاجي إلى المتوسطة من أجل مراقبة تأثيره على الناتج الوظيفي للخلايا المستزرعة.
21. إجراء تقييمات التعب من خلال تحفيز الخلايا كهربائيا لفترات طويلة ومستويات المسح الضوئي للمقاولات actility لقياس الزمن الذي يستغرقه لاستخدام القوة لإسقاط الذروة دون عتبة معينة.
22. في التجارب حيث تتم المحافظة على الخلايا العصبية الحركية في ثقافة مشتركة مع العضلات، وقياس تشكيل تقاطع العصبي العضلي من خلال علاج العصبون الحركي-myotube ناتئ المشترك الثقافات مع المنشطات العصبية (مثل الصوديوم) أو مثبط متشابك (على سبيل المثال، D-توبوكورارين) والمسح الضوئي لل الزيادة والنقصان في النشاط العفوي على التوالي ^16.
23. القيام بمسح محددة وفقا لما تمليه احتياجات التجارب المخطط لها.

5. تحليل البيانات الكابولي الإمالة

1. استخدام تعديل المعادلات ستوني في ¹⁵ (مفصلة أدناه) لتحويل البيانات ناتئ الخام انحراف (في فولت) في قراءات الضغط في طبقة الخلايا أو myotube (قراءة الضغط بمقياس الباسكال)، والقياس المباشر للقوة مقلص الخلوية (في نانو نيوتن):
   إعلان / 51866 / 51866eq1.jpg "/> المعادلة 1
   المعادلة 2
2. حيث δ = طرف ناتئ انحراف والإجهاد التي تنتجها myotube، σ _ج = الإجهاد التي تنتجها myotube، على افتراض فيلم سميكة موحد العرض الكامل للناتئ، C = _كاشف معامل الخاصة بالنظام المتعلقة الجهد لوضع الليزر على الصورة -detector، θ = زاوية الليزر وكاشف نسبة إلى الطائرة من ناتئ، E _سي = معامل مرونة من السيليكون، تي _سي = سمك من ناتئ، ر _و = سمك myotube، ضد _سي = نسبة السم لل السيليكون، L = طول الكابولي، P = طول طريق الليزر من ناتئ تلميح إلى كاشف، وث _{سي = العرض من ناتئ. ويرد التخطيطي شرح المصطلحات المستخدمة في هذه المعادلات في الشكل 6.}
3. على افتراض myotube هو فيلم موحدة، قوة في myotube تساوي القوة في الفيلم، مما يؤدي إلى المعادلة 3، عن طريق المساواة بين حساب القوة من الإجهاد ومنطقة يفترض عبر خلية المقطع الذي تم استخدامه لتطبيق في ستوني المعادلة.
   المعادلة 3
4. وبعد جمع البيانات وظيفية، إصلاح رقائق ناتئ لتحليل immunocytochemical أو استخدام الخلايا للبروتين أو تحليل DNA باستخدام التقنيات القياسية.
5. اختياريا، والعودة إلى الخلايا الحاضنة بدلا من الاستعداد للتحليل الجزيئي من أجل إعادة تقييم الأداء الوظيفي في وقت لاحق نقطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ثقافة ناجحة من خلايا مقلص على الكابولي هو إجراء بسيط نسبيا، وذلك باستخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية (الشكل 5). نسبة الكابولي دعم خلايا التعاقد سوف تختلف تبعا لنوع من الخلايا يجري بحثها وتقنية ثقافة معينة يعمل. استخدام الخلايا الجنينية الأولية المستمدة م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الخطوات الحاسمة في تحليل الكابولي الميكروسكيل عن أدلة على انكماش الخلوية هي وضع رقاقة ناتئ داخل المسرح المجهر، والمحاذاة لاحقة من الليزر والصور كاشف مع غيض من الكابولي الزاوية في الصفيف. إذا لم يتم ذلك بدقة، ثم لن تكون قادرة على استقراء مواقف الكابولي المتبقية في مج...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ml
Ciliary Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ml
Neurotrophin-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ml
Neurotrophin-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ml
Acidic Fibroblast Growth Factor	Life Technologies	13241-013	25 ng/ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ml
Heparin Sulphate	Sigma	D9809	100 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158	20 ng/ml
Vitronectin	Sigma	V0132	100 ng/ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
Equipment
Class 2 red diode laser	Newport
Photo-detector	Noah Industries
Model 2100 Pulse stimulator	A-M systems
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments
Patch clamp microscope and stage	Olympus
Delta T4 culture dish controller	Bioptechs
Axoscope software	Molecular Devices
LabVIEW software	National Instruments
37 oC, 5% CO2 incubator	NAPCO
Class 2 microbiological flow hood	Labconco
Pipettes and tips	Eppendorf