L&#39;utilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction<em&gt; In Vitro</em

Résumé

Ce protocole décrit l'utilisation de leviers de silicium micro-échelle que les surfaces souples de culture pour mesurer la contractilité des cellules musculaires in vitro. Contraction cellulaire provoque une flexion en porte à faux, qui peut être mesuré, enregistré et converti en lectures de force, en fournissant un système non invasif pour la mesure et s'adaptent fonction contractile in vitro.

Résumé

Le développement de tests in vitro prédictifs et biologiquement pertinents repose sur la promotion des systèmes de culture cellulaire polyvalents qui facilitent l'évaluation fonctionnelle des cellules ensemencées. A cet effet, la technologie de micro-cantilever offre une plate-forme permettant de mesurer les fonctions de contraction d'une gamme de types de cellules, y compris squelettique, cardiaque, et les cellules musculaires lisses, grâce à l'évaluation de la contraction induite par le substrat de pliage. Application des réseaux multiplexés en porte à faux fournit les moyens pour développer des protocoles modérée à forte capacité d'évaluation de l'efficacité des médicaments et de la toxicité, le phénotype de la maladie et de progression, ainsi que les interactions neuromusculaires et autre cellule-cellule. Ce manuscrit fournit les détails de fabrication de tableaux en porte à faux fiables à cet effet, et les méthodes requises pour mener des cellules de culture sur ces surfaces. Une description plus détaillée est fournie sur les mesures nécessaires pour effectuer anal fonctionnelleyse de types de cellules contractiles maintenu sur de tels réseaux à l'aide d'un laser selon l'invention et d'un système photo-détecteur. Les données représentatives présente les points saillants de la précision et de la nature reproductible de l'analyse de la fonction contractile possible d'utiliser ce système, ainsi que le large éventail d'études à laquelle cette technologie peut être appliquée. L'adoption généralisée de succès de ce système pourrait fournir aux enquêteurs les moyens d'effectuer des études fonctionnelles, à faible coût rapides in vitro, conduisant à des prévisions plus précises de la performance des tissus, le développement de la maladie et la réponse au traitement thérapeutique.

Introduction

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades^1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro^3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option^6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models¹¹.

Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells^12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology¹⁴, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection¹⁵. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies^15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.

This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

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Protocole

1.-faux fabrication de puces

Détails illustrés des étapes de fabrication décrites sont fournies sur la figure 1.

1. Placez plaques de silicium sur isolant (SOI) dans un four et cuire au four à 125 ° C pendant 20 min pour les déshydrater.
2. Déposer une couche épaisse d'oxyde de silicium de 1,5 pm sur la couche de poignée de la plaquette SOI déshydraté au moyen d'un Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) outil.
3. Placer la plaque sur le mandrin de spin d'enduction de la couche de dispositif vers le haut. Assurez-plaquette est centrée, de distribuer 2 ml de P20 amorce sur le centre de la plaque, et tournent à 3000 tours par minute pendant 60 secondes à une accélération de 1000 rpm / sec. P20 amorce favorise l'adhérence du vernis photosensible à la couche de dispositif.
4. Bien que la tranche est encore sur le mandrin tournette, distribuer 2 ml de S1818 résine photosensible sur le centre de la plaquette, et centrifuger à 3000 tours par minute pendant 60 secondes à une accélération de 1000 tours par minute / seconde à obtain une épaisse couche de résine photosensible de 1,5 um.
5. Placer la plaque sur une plaque chauffante et effectuer une cuisson douce à 115 ° C pendant 1 min.
6. Effectuer une exposition Contact avec les UV dur à l'aide d'un masque d'alignement de contact de photolithographie afin de transférer le motif du masque en porte à faux de la résine photosensible sur la couche de l'appareil. Calculer le temps d'exposition en fonction de l'exposition valeur énergétique de 125 mJ / cm ² pour S1818 résine photosensible.
7. Développer la résine photosensible par immersion de la plaquette dans un MIF développeur 726 de résine photosensible pour 1 min en agitant doucement la tranche d'avant en arrière.
8. Rincer la plaquette avec (DI) de de-ionisée et sécher, de préférence en utilisant un outil essoreuse de rinçage (SRD).
9. Retirer la résine photosensible à partir du bord de la plaquette (jusqu'à 5 mm du bord) en utilisant un tampon de coton trempé dans de l'acétone.
10. Chargez la plaquette dans un outil Deep Reactive Ion Etch (DRIE), avec le côté de résine photosensible vers le haut, et exécuter une recette pour graver la couche de silicium motifs par la devicouche CE. Les fonctions de la couche d'oxyde enterrée comme un arrêt de gravure, de manière à effectuer une attaque chimique de 50% à 100% de cycles que l'on attend d'être nécessaire pour assurer une gravure complète.
11. Placer la plaque dans une solution de bain de résine photosensible à chaud pendant 20 minutes pour enlever la résine photosensible. Transférer la tranche à une rapide décharge-Rince (QDR) pour rincer la tranche avec de l'eau DI. Après la bande de résine photosensible, charger la plaquette dans un outil de SRD à rincer et sécher la plaquette. Vérifier la plaquette sous un microscope à assurer la configuration en porte à faux apparaît comme prévu.
12. Déposer une couche de 1 um d'épaisseur d'oxyde de silicium non dopé sur la couche de dispositif de la plaquette à l'aide d'un outil de PECVD. Cette fonction de couche d'oxyde en tant que couche de protection pour les leviers au cours des étapes de traitement.
13. Placer la plaque sur le mandrin de spin d'enduction de la couche de poignée orientée vers le haut pour commencer le traitement de la face arrière de la plaquette. Assurer plaquette est centrée, de distribuer 2 ml de P20 amorce sur le centre de la plaque, et tournent à 3000 tours par minutependant 60 secondes à une accélération de 1000 rpm / sec.
14. Bien que la tranche est encore sur le mandrin tournette, 2 ml de distribuer SPR220-4.5 résine photosensible sur le centre de la plaquette, et centrifuger à 2000 tours par minute pendant 45 secondes à une accélération de 1000 tours par minute / seconde pour obtenir une épaisseur de couche de 6,5 pm résine photosensible.
15. Placer la plaque sur une plaque chaude de proximité pour effectuer une cuisson douce à 115 ° C pendant 2 min.
16. Utilisation d'une photolithographie de contact d'alignement capable de recto / verso alignement, aligner le masque de la fenêtre du côté arrière de la configuration en porte à faux du côté avant et effectuer une exposition aux UV de contact dure, afin de transférer le motif sur le masque de la fenêtre du côté arrière de la résine photosensible sur la couche de poignée. Utilisez un temps d'exposition calculée sur la base de l'exposition valeur énergétique de 480 mJ / cm ² pour SPR220-4.5 résine photosensible.
17. Après l'exposition aux UV, que les plaquettes restent dans une zone sombre pendant 30 min avant l'étape de traitement suivante.
18. Développer la résine photosensible par trempage de la plaque enun développeur 726 MIF de résine photosensible pendant 2 min en agitant doucement la tranche d'avant en arrière.
19. Rincer la plaquette avec (DI) de de-ionisée et sécher, de préférence en utilisant un outil essoreuse de rinçage (SRD).
20. Placer les tranches dans un four à 90 ° C pendant 12 heures.
21. Graver la couche d'oxyde de silicium sur la face arrière de la tranche en utilisant un système de RIE avec des gaz fluorés et une recette pour la gravure de l'oxyde. L'oxyde à motifs sur la face arrière de la plaquette joue le rôle d'un masque de gravure pour la suite du traitement. Inspecter les plaquettes au microscope pour s'assurer que l'oxyde de silicium exposé dans la fenêtre est complètement décapée.
22. Retirer la résine photosensible sur le bord de la plaquette (jusqu'à 5 mm du bord) en utilisant un tampon de salle blanche trempée dans de l'acétone.
23. Charger la plaquette dans un outil de DRIE et de fonctionner avec une recette pour graver la couche de poignée motif jusqu'à une profondeur de 500 um avec le fonctionnement de la couche d'oxyde enterrée dans un arrêt de gravure. Diviser cette gravure en plusieurs pistes pour éviter un échauffement excessif de lagaufrette, ce qui provoque la gravure du silicium incompatible. Cette étape de gravure élimine complètement le silicium sous les encorbellements.
24. Réaliser une étape de gravure humide en utilisant 25% de HF dilué agent de gravure, à enlever la couche d'oxyde enterrée en dessous des consoles et la couche protectrice d'oxyde au-dessus des consoles.
    REMARQUE: Cette étape libère la surface inférieure des consoles de silicium et ouvre une nouvelle fenêtre pour fournir un accès à la sonde en porte à faux avec le laser aussi.
25. Rincer la plaque à l'aide d'une série de DI bains d'eau et sécher soigneusement avec de l'azote. Depuis les consoles sont pris en charge uniquement par leurs bases, ne pas utiliser de sprays d'eau puissant DI ou un gaz inerte directement sur les consoles.
26. Cliver les puces individuelles à partir de la tranche le long des lignes de clivent les produits au cours de l'étape de gravure de la couche poignée.

2. culture cellulaire

1. Préparer 13F lamelles selon des méthodes ¹⁷ précédemment publiés.
   REMARQUE: Si 13F anserslips ne sont pas disponibles, toute surface hydrophobe avec un angle de contact au-dessus de 95 ° peut être utilisé.
2. Stériliser puces en porte-lamelles et 13F dans une solution d'éthanol à 70% et laisser sécher à l'air dans une hotte à flux.
3. Placez puces individuelles en porte à faux au-dessus de 13F lamelles dans une plaque 12 puits standard.
4. Enduire les cantilevers avec la modification d'un biopolymère ou d'une surface optimisé pour le type de cellules utilisées selon les protocoles de culture cellulaire standard.
5. Re-suspendre les cellules dans leur milieu de croissance spécifique à la concentration désirée.
   NOTE: Ce protocole se traduira par un nombre important de cellules tombant à travers la fenêtre en porte à faux et qui n'adhère pas à la surface du cantilever souhaitée. préparations de cellules doivent donc être faits 3-4x plus concentré que pour les préparations de lamelle standard. Par exemple, l'ensemencement de cellules satellites de muscle squelettique de rat est généralement réalisée en utilisant une densité d'ensemencement de 500 à 700 cellules / mm carré ^15,16, Et sont utilisés avec des substrats en porte à faux à 2000 cellules / mm carré. des expériences d'optimisation doivent être effectuées avec de nouvelles sources de cellules pour déterminer une densité d'ensemencement appropriée.
6. Pipeter 200 ul de la suspension cellulaire sur la surface de la puce en porte à faux assurant la bulle de support recouvre les fenêtres entièrement en porte à faux. Si le milieu évacue à travers la fenêtre et ne forme pas de bulles statique au-dessus des consoles remplacer la lamelle couvre-13F et retenter le placage.
7. Transférer la plaque contenant les jetons à un incubateur et permettent aux cellules d'adhérer pendant au moins 1 heure (de préférence 2-3 h).
8. Après cette période de placage, utiliser des pinces stériles pour transférer la puce à un bien propre, sans une lamelle 13F, et haut la culture avec 1 ml de milieu de croissance.
9. Retour de la plaque dans l'incubateur.
10. Maintenir les cellules en fonction de leur protocole standard pour l'entretien in vitro sur des lamelles. Pour les cellules des muscles squelettiques,un commutateur de composition de milieu pour induire la formation de myotubes une fois que les cellules deviennent confluentes sera nécessaire.

3 Configuration du matériel et des logiciels d'analyse Cantilever Déviation

1. Placez une boîte de culture chauffée dans le stade d'un microscope droit électrophysiologie.
2. Ajouter 3 ml du milieu d'alimentation, les cellules sont mises en suspension dans le moment (+ 10 mM de HEPES) de la platine du microscope chauffée.
3. Montage d'électrodes en acier inoxydable à l'intérieur de la boîte de culture chauffé à une distance de séparation de 15 mm et de les relier à un générateur d'impulsions, capable de produire des impulsions de stimulation du champ de variation de l'intensité, la fréquence et la forme d'onde, pour permettre au système de produire une stimulation de champ de cellules, le cas échéant.
4. Visser un laser Hélium-Néon, monté sur des étages de translation XY, à la face inférieure de la table de microscope et de l'ajuster de telle sorte que le faisceau laser est dirigé à travers le fond de la boîte de culture chauffé à une relativ 30 ° d'anglee par rapport au plan de la console.
5. Visser un module photo-détecteur à quadrants, monté sur les scènes de translation XY, à la face inférieure de la platine du microscope et régler la position de sorte que les terres de faisceau laser réfléchi dans le centre des 4 quadrants. Figure 2 donne un aperçu du matériel mis en place nécessaire pour mettre en œuvre le protocole décrit.
6. Écrire un programme de logiciel pour contrôler les actionneurs linéaires qui scannent à travers les consoles. Écrire le programme de logiciel, en référence à l'organigramme présenté à la figure 3. L'interface graphique programmé pour être utilisé avec ce système est présenté à la figure 4.

4. enregistrement Cantilever Déviation données

1. Allumer le matériel d'analyse en porte à faux et le logiciel associé.
2. Insérez la thermistance de la scène chauffée dans le milieu et attendre pour lire 37 ° C.
3. Insérez la puce en porte à faux dans la scène avec le cantilevers orientés vers le côté droit de la scène.
4. Allumer la source de lumière du microscope.
5. La mise au microscope pour amener les bords des consoles en vue et utiliser le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur pour positionner le faisceau laser sur la pointe du cantilever 1 REMARQUE: En supposant que les consoles sont orientés vers la droite de la scène, cantilever 1 est l'un positionné dans le coin supérieur gauche de la matrice et le nombre descendent jusqu'à 16 en bas à gauche. Cantilever 17 est dans la position en haut à droite et tourne à 32 en bas à droite (figure 5A).
6. Appuyez sur "play" sur le logiciel d'enregistrement.
7. Positionner le photo-détecteur de sorte que le signal indique "0" dans les deux x et y trames en ajustant les moteurs pas à pas commandant le photo-détecteur.
8. Réglez cantilever 1 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur (Figure 4).
9. Déplacez le laser à la pointe du cantilever 16, répéter l'étape 4.7., Et mettre cantilever 16 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur.
10. Déplacez le laser à la pointe du cantilever 32, répéter l'étape 4.7., Et mettre en porte à faux 32 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur.
11. Déplacez le laser à la pointe du cantilever 17, répéter l'étape 4.7., Et mettre en porte à faux 17 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur.
12. Coupez la source de lumière du microscope et le plafonnier dans le laboratoire.
13. Appuyez sur "enregistrer" sur le logiciel d'enregistrement.
14. Réglez le matériel générateur d'impulsions à 40 ms, 5 V impulsions à une fréquence de 1 Hz, et allumer la machine.
    NOTE: En option, emploient des protocoles de stimulation optimisés pour les sources de cellules spécifiques à ce stade, les paramètres indiqués sont des lignes directrices fondées sur des données recueillies à l'aide de sources ^12,13,15,16 cellulaires humaines et de rongeurs.
15. En utilisant le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur, régler le matériel pour numériser à travers le réseau 32 en porte à faux, l'arrêt pendant 5 secondes à chaque sure.
16. Lorsque l'analyse des 32 consoles est terminée, éteignez le stimulateur, puis arrêtez le logiciel d'enregistrement et d'élever le fichier de données.
17. Examinez la trace enregistrée de chaque console de preuves de l'activité contractile. Prenez note de chaque porte à faux avec les réponses positives. Une contraction est définie comme étant un pic si la déviation est au moins de 0,1 V au-dessus de la ligne de base.
18. Retirez toutes les consoles non-sensibles du protocole de numérisation sur le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur.
19. Les cantilevers actifs peuvent ensuite être réanalysés sans stimulation afin d'obtenir une lecture de l'activité contractile spontanée de la cellule.
20. Exécuter des analyses large avec ou sans stimulation électrique de champ, après l'addition d'un composé thérapeutique dans le milieu pour observer son effet sur la sortie fonctionnelle des cellules en culture.
21. Réaliser des évaluations de la fatigue en stimulant électriquement les cellules pendant de longues périodes et les niveaux de contr de numérisation Actility de mesurer combien de temps il faut pour force maximale de descendre en dessous d'un certain seuil.
22. Dans les expériences où les motoneurones sont maintenues en co-culture avec les muscles, mesurer la formation de la jonction neuromusculaire par le traitement des motoneurones-myotubes cantilever co-cultures avec un stimulant neuronal (tel que le glutamate) ou inhibiteur de la synaptique (par exemple, d-tubocurarine) et de balayage pour augmentations et les diminutions de l'activité spontanée respectivement ^16.
23. Effectuer des analyses spécifiques comme dicté par les besoins des expériences prévues.

5 Analyse des données Cantilever Déviation

1. Utilisez modifié les équations de Stoney ¹⁵ (détaillées ci-dessous) pour convertir les données en porte à faux brut de déviation (en Volts) en une lecture de stress dans la couche de cellules ou myotubes (en Pascals), et une mesure directe de la force contractile cellulaire (en nano-Newton):
   annonce / 51866 / 51866eq1.jpg "/> l'équation 1
   Equation 2
2. Où δ = cantilever béquillage et le stress produites par les myotubes, σ _c = contrainte produite par les myotubes, en supposant un film d'épaisseur uniforme sur toute la largeur de la poutre, C _détecteur = le coefficient spécifique au système concernant la tension de mesure à laser sur la photo -detector, θ = l'angle du laser et du détecteur par rapport au plan de la poutre, E _Si = le module d'élasticité de silicium, t _Si = l'épaisseur du cantilever, t _f = épaisseur de myotubes, v _Si = coefficient de poison de silicium, L = longueur en porte à faux, P = longueur du chemin laser à partir de la pointe de cantilever à détecteur, et w _{Si = la largeur de la poutre. Un schéma expliquant les termes utilisés dans ces équations est présenté à la figure 6.}
3. En supposant que la myotubes est un film uniforme, la force dans la myotubes est égale à la force dans le film, ce qui conduit à l'équation 3, en assimilant le calcul de la force contre le stress et la zone de section transversale de la cellule présumée qui a été utilisé pour l'application de Stoney de équation.
   Équation 3
4. Après la collecte de données fonctionnelles, fixer des puces en porte à faux pour l'analyse immunocytochimique ou utiliser des cellules pour l'analyse des protéines ou de l'ADN en utilisant des techniques standard.
5. En option, retourner les cellules à l'incubateur au lieu de préparer pour l'analyse moléculaire afin de réévaluer la performance fonctionnelle à un point de temps plus tard.

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Résultats

Culture réussie des cellules contractiles sur des consoles est une procédure relativement simple, en utilisant des techniques classiques de culture cellulaire (figure 5). Le pourcentage de consoles supportant les cellules contractants varie en fonction du type de cellule en cours d'examen et la technique de culture spécifique utilisé. En utilisant des cellules embryonnaires primaires dérivées de membres postérieurs chez le rat, l'activité contractile a été détecté sur 12% des cantile...

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Discussion

Les étapes essentielles de l'analyse microscopique des consoles de preuve de contraction cellulaire sont le placement de la puce de porte à faux à l'intérieur de la platine du microscope, et l'alignement ultérieur du laser et photo-détecteur à l'extrémité des leviers de coin dans la matrice. Si ce n'est pas fait correctement, le logiciel ne pourra pas extrapoler les positions des consoles restantes dans le tableau, qui pourrait conduire à l'accumulation de faux négatifs lors de la coll...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ml
Ciliary Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ml
Neurotrophin-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ml
Neurotrophin-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ml
Acidic Fibroblast Growth Factor	Life Technologies	13241-013	25 ng/ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ml
Heparin Sulphate	Sigma	D9809	100 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158	20 ng/ml
Vitronectin	Sigma	V0132	100 ng/ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
Equipment
Class 2 red diode laser	Newport
Photo-detector	Noah Industries
Model 2100 Pulse stimulator	A-M systems
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments
Patch clamp microscope and stage	Olympus
Delta T4 culture dish controller	Bioptechs
Axoscope software	Molecular Devices
LabVIEW software	National Instruments
37 oC, 5% CO2 incubator	NAPCO
Class 2 microbiological flow hood	Labconco
Pipettes and tips	Eppendorf