L&#39;utilizzo di microscala Silicon cantilever per valutare Cellular contrattile Funzione<em&gt; In Vitro</em

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'uso di cantilever silicio microscala come superfici di coltura flessibili per misurare la contrattilità delle cellule muscolari in vitro. Contrazione cellulare provoca cantilever flessione, che può essere misurata, registrata e convertita in letture di forza, fornendo un sistema non invasivo e scalabile per misurare funzione contrattile in vitro.

Abstract

Lo sviluppo di test più predittivi e biologicamente rilevanti in vitro si basa sulla promozione dei sistemi di coltura di cellule versatili che facilitano la valutazione funzionale delle cellule teste di serie. A tal fine, la tecnologia cantilever microscala offre una piattaforma con cui misurare la funzionalità contrattile di una gamma di tipi cellulari, incluse scheletrico, cardiaco e cellule muscolari lisce, attraverso la valutazione della contrazione indotta substrato piegatura. Applicazione di matrici a sbalzo multiplex fornisce i mezzi per sviluppare moderata a protocolli di high-throughput per valutare l'efficacia dei farmaci e la tossicità, fenotipo della malattia e la progressione, così come le interazioni neuromuscolari e altri cellula-cellula. Questo manoscritto fornisce i dettagli per la fabbricazione di matrici a sbalzo affidabili per questo scopo, ed i metodi necessari al successo le cellule di coltura su queste superfici. Ulteriore descrizione è fornita sui passi necessari per eseguire anale funzionaleYsis di tipi di cellule contrattili mantenuta su tali array utilizzando un nuovo sistema laser e foto-rilevatore. I dati rappresentativi forniti evidenzia la precisione e la natura riproducibile dell'analisi della funzione contrattile possibile utilizzare questo sistema, così come la vasta gamma di studi cui tale tecnologia può essere applicata. Adozione diffusa di successo di questo sistema potrebbe fornire gli investigatori i mezzi per eseguire rapidi, studi funzionali a basso costo in vitro, portando a previsioni più accurate delle prestazioni dei tessuti, lo sviluppo della malattia e la risposta al trattamento terapeutico.

Introduzione

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades^1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro^3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option^6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models¹¹.

Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells^12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology¹⁴, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection¹⁵. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies^15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.

This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

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Protocollo

1 Cantilever Chip Fabrication

Dettagli illustrati delle fasi di fabbricazione descritti sono forniti in Figura 1.

1. Posizionare wafer di silicio su isolante (SOI) in un forno e cuocere a 125 ° C per 20 min a disidratarsi loro.
2. Depositare uno spesso strato di ossido di silicio 1,5 micron sullo strato maniglia del wafer SOI disidratato usando un potenziato a plasma Chemical Vapor Deposition (PECVD) dell'utensile.
3. Posizionare la cialda sul mandrino di spin coater con lo strato dispositivo rivolto verso l'alto. Assicurarsi wafer è centrata, dispensare 2 ml di P20 Primer sul centro della fetta, e centrifuga a 3000 rpm per 60 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec. P20 Primer promuove l'adesione del fotoresist allo strato dispositivo.
4. Mentre il wafer è ancora sul mandrino di spin coater, dispensare 2 ml di S1818 fotoresist sul centro della fetta, e centrifuga a 3000 rpm per 60 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec obtain uno spesso strato di resina fotosensibile 1,5 micron.
5. Inserire la cialda su una piastra calda ed effettuare una cottura morbida a 115 ° C per 1 min.
6. Eseguire un'esposizione contatto UV disco utilizzando un contatto fotolitografia maschera allineatore per trasferire il disegno dalla maschera sbalzo per il fotoresist sullo strato del dispositivo. Calcolare il tempo di esposizione in base al valore energetico di esposizione di 125 mJ / cm ² per S1818 photoresist.
7. Sviluppare il photoresist immergendo la fetta in una MIF autore fotoresist 726 per 1 min, agitando delicatamente il wafer avanti e indietro.
8. Sciacquare il wafer con (DI) di acqua deionizzata e asciugare, preferibilmente utilizzando uno spin risciacquo biancheria (SRD) strumento.
9. Rimuovere il fotoresist dal bordo del wafer (fino a 5 mm dal bordo) usando un batuffolo di cotone imbevuto di acetone.
10. Caricare il wafer in un Reactive Ion Etch (DRIE) strumento profonda, con il lato fotosensibile rivolto verso l'alto, ed eseguire una ricetta per incidere lo strato di silicio modellato attraverso la devistrato di ce. Le funzioni di strato di ossido sepolto come un arresto etch, quindi eseguire un attacco con il 50% al 100% più cicli che si prevede sarà necessario per garantire una completa etch.
11. Posizionare la cialda in una soluzione bagno photoresist caldo per 20 minuti a nudo il photoresist. Trasferire la cialda di un rapido-dump-sciacquatrice (QDR) per sciacquare la cialda con acqua deionizzata. Dopo la striscia di photoresist, caricare la cialda in uno strumento di dominio di risorse condivise per sciacquare e asciugare il wafer. Controllare il wafer al microscopio per assicurare lo schema cantilever visualizza come previsto.
12. Depositare uno strato di ossido di silicio drogato un-1 micron sullo strato periferica del wafer con un attrezzo PECVD. Funzioni di questo strato di ossido, come uno strato protettivo per i cantilever durante ulteriori fasi di lavorazione.
13. Posizionare il wafer sul mandrino rotazione coater con lo strato rivolto verso l'alto la maniglia per iniziare l'elaborazione del lato posteriore del wafer. Garantire wafer è centrata, dispensare 2 ml di P20 Primer sul centro della fetta, e centrifuga a 3000 rpmper 60 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec.
14. Mentre il wafer è ancora sul mandrino di spin coater, dispensare 2 ml di SPR220-4.5 fotoresist sul centro della fetta, e centrifugare a 2000 rpm per 45 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec per ottenere uno spesso strato di 6,5 micron photoresist.
15. Inserire la cialda su una piastra calda vicinanza effettuare una cottura morbida a 115 ° C per 2 min.
16. Utilizzando un contatto fotolitografia allineatore grado di anteriore / posteriore allineamento, allineare la maschera finestra posteriore al modello cantilever lato anteriore ed eseguire un hard esposizione ai raggi UV contatto per trasferire il disegno dalla maschera finestra posteriore per il fotoresist sullo strato maniglia. Utilizzare un tempo di esposizione calcolato in base al valore energetico di esposizione di 480 mJ / cm ² per SPR220-4.5 photoresist.
17. Dopo l'esposizione ai raggi UV, lasciare che i wafer rimangono in una zona scura per 30 minuti prima della prossima fase di lavorazione.
18. Sviluppare il photoresist immergendo il wafer inuno sviluppatore 726 MIF photoresist per 2 minuti mentre delicatamente scuotendo il wafer avanti e indietro.
19. Sciacquare il wafer con (DI) di acqua deionizzata e asciugare, preferibilmente utilizzando uno spin risciacquo biancheria (SRD) strumento.
20. Posizionare i wafer in un forno a 90 ° C per 12 ore.
21. Etch lo strato di ossido di silicio sul retro del wafer utilizzando un sistema RIE con gas fluorurati e una ricetta per incisione ossido. L'ossido modellata sul retro della fetta agisce come una maschera di attacco per l'ulteriore elaborazione. Controllare i wafer al microscopio per assicurare che l'ossido di silicio nella finestra esposta è completamente inciso.
22. Rimuovere il photoresist sul bordo del wafer (fino a 5 mm dal bordo) usando una camera tampone pulito imbevuto in acetone.
23. Caricare il wafer in un utensile con DRIE ed eseguire una ricetta per incidere lo strato maniglia modellata ad una profondità di 500 micron con il funzionamento strato di ossido sepolto come arresto etch. Dividere questo etch in più piste per impedire un eccessivo riscaldamento delwafer, che provoca incisione incoerente del silicio. Questo passaggio etch rimuove completamente il silicio sotto i cantilever.
24. Eseguire una fase di attacco umido utilizzando il 25% diluito HF mordenzante, per togliere lo strato di ossido sepolto sotto i cantilever e lo strato di ossido protettivo sulla parte superiore del cantilever.
    NOTA: Questo passaggio rilascia la superficie inferiore dei cantilever in silicio e apre una finestra sotto per fornire un accesso per sondare la mensola con il laser.
25. Sciacquare la cialda con una serie di bagni di acqua deionizzata e asciugare accuratamente con azoto. Dal momento che i cantilever sono supportate solo alle loro basi, non utilizzare spray forti d'acqua DI o gas inerte direttamente sui cantilever.
26. Cleave i singoli chip dal wafer lungo le linee Cleave prodotti durante la fase maniglia strato etch.

Cultura 2. cellulare

1. Preparare 13F coprioggetto secondo i metodi precedentemente pubblicati ^17.
   NOTA: Se 13F coverslips non sono disponibili, qualsiasi superficie idrofobica con un angolo di contatto sopra 95 ° può essere utilizzato.
2. Sterilizzare chip a sbalzo e 13F coprioggetto in una soluzione di etanolo al 70% e lasciare asciugare in una cappa a flusso.
3. Posizionare singoli chip a sbalzo sulla parte superiore del 13F vetrini all'interno di una piastra standard 12 bene.
4. Rivestire le cantilever con la modifica biopolimero o superficie ottimizzata per il tipo di cellule utilizzate secondo i protocolli standard di coltura cellulare.
5. Risospendere le cellule nel loro terreno di crescita specifico alla concentrazione desiderata.
   NOTA: Questo protocollo si tradurrà in un notevole numero di cellule che cadono attraverso la finestra a sbalzo e non aderenti alla superficie cantilever desiderato. Preparazioni di cellule devono pertanto essere 3-4 volte più concentrato di quello per le preparazioni coprioggetto standard. Ad esempio, la semina di cellule satelliti muscolari scheletrico di ratto è tipicamente effettuata con una densità di semina di 500 e 700 cellule / quadrato mm ^15,16, E sono usati con supporti a sbalzo a 2.000 cellule / mm quadrato. Esperimenti di ottimizzazione devono essere effettuate con le nuove fonti di cellule per accertare una adeguata densità di semina.
6. Pipettare 200 microlitri della sospensione cellulare sulla superficie del chip cantilever, assicurando la bolla di media copre le finestre a sbalzo interamente. Se il mezzo assorbe attraverso la finestra e non forma una bolla statica sulla parte superiore del cantilever sostituire il coprioggetto 13F e ritentare il fasciame.
7. Trasferire il piatto contenente i chip di un incubatore e permettono alle cellule di aderire per almeno 1 ora (preferibilmente 2-3 ore).
8. Dopo questo periodo di placcatura, utilizzare pinze sterili per trasferire il chip di un ben pulito, senza coprioggetto 13F, e rabboccare la cultura con 1 ml di terreno di coltura.
9. Riportare la piastra per l'incubatore.
10. Mantenere le cellule in base alla loro protocollo standard per la manutenzione in vitro su vetrini. Per le cellule del muscolo scheletrico,un interruttore di media composizione per indurre la formazione di miotubi una volta le cellule diventano confluenti sarà necessario.

3 Configurazione di hardware e software per l'analisi sbalzo Flessione

1. Posizionare un piatto di coltura riscaldato nella fase di un microscopio elettrofisiologia in posizione verticale.
2. Aggiungere 3 ml del mezzo di alimentazione delle celle sono attualmente sospesi in (HEPES mM + 10) alla fase microscopio riscaldata.
3. Montare elettrodi inox sulla parte interna del piatto cultura riscaldata ad una distanza di 15 mm e collegarli ad un generatore di impulsi, in grado di produrre impulsi di stimolazione campo di varia intensità, frequenza e forma d'onda, per permettere al sistema di produrre stimolazione del campo delle cellule quando appropriato.
4. Fissare un laser a elio-neon, montato su fasi di traslazione XY, alla parte inferiore del tavolo microscopio e regolare in modo che il fascio laser è diretto attraverso la base del piatto cultura riscaldata a 30 ° relativposta al piano del cantilever.
5. Fissare un modulo foto-rilevatore quadrante, montato su fasi di traslazione XY, alla parte inferiore del palco microscopio e regolare la posizione in modo che i riflessi terre raggio laser al centro dei quattro quadranti. Figura 2 fornisce una panoramica dell'hardware istituito necessarie per l'attuazione del protocollo descritto.
6. Scrivere un programma software per controllare gli attuatori lineari che scandiscono attraverso i cantilever. Scrivere il programma software con riferimento al diagramma di flusso illustrato nella Figura 3. L'interfaccia grafica programmato per l'uso con questo sistema è fornito in Figura 4.

4 Registrazione Cantilever deflessione dei dati

1. Accendere l'hardware di analisi cantilever e software associato.
2. Inserire il palco termistore riscaldato nel mezzo e attendere che la lettura a 37 ° C.
3. Inserire il chip a sbalzo in fase con il cantilevers orientati verso il lato destro del palco.
4. Accendere la sorgente di luce del microscopio.
5. Mettere a fuoco il microscopio per portare i bordi dei cantilever in vista e utilizzare il software di controllo laser / foto-rilevatore per posizionare il raggio laser sulla punta del cantilever 1 NOTA: Supponendo che i cantilever sono orientati alla destra del palco, cantilever 1 è quello posizionato in alto a sinistra della matrice e numeri scendono a 16 in basso a sinistra. Mensola 17 è nella posizione in alto a destra e corre a 32 in basso a destra (Figura 5A).
6. Premere il tasto "play" sul software di registrazione.
7. Posizionare la foto-rivelatore in modo che il segnale indica "0" in entrambi x ed y fotogrammi regolando i motori passo-passo che controllano la foto-rivelatore.
8. Impostare cantilever 1 posizione nel software di controllo laser / foto-rilevatore (Figura 4).
9. Spostare il laser alla punta del cantilever 16, ripetere il punto 4.7., E impostare cantilever 16 posizione nel software di controllo laser / foto-rivelatore.
10. Spostare il laser alla punta del cantilever 32, ripetere il punto 4.7., E impostare sbalzo 32 posizione nel software di controllo laser / foto-rivelatore.
11. Spostare il laser alla punta del cantilever 17, ripetere il punto 4.7., E impostare sbalzo 17 posizione nel software di controllo laser / foto-rivelatore.
12. Spegnere la fonte di luce microscopio e la plafoniera in laboratorio.
13. Premere il tasto "record" sul software di registrazione.
14. Impostare l'hardware generatore di impulsi di 40 msec, 5 V impulsi ad una frequenza di 1 Hz, e accendere la macchina.
    NOTA: In alternativa, impiegare protocolli di stimolazione ottimizzate per fonti di cellule specifiche, a questo punto, le impostazioni indicate sono linee guida basate su dati raccolti utilizzando fonti umane e cellule di roditore ^12,13,15,16.
15. Utilizzando il software di controllo laser / foto-rivelatore, impostare l'hardware per eseguire la scansione attraverso la matrice 32 cantilever, fermandosi per 5 secondi ad ogni sue.
16. Quando la scansione dei 32 cantilever è completata, spegnere lo stimolatore, quindi arrestare il software di registrazione e aprire il file di dati.
17. Esaminare la traccia registrata da ogni sbalzo per prove di attività contrattile. Prendere nota di ciascuna mensola con le risposte positive. Una contrazione è definito come un picco se la deviazione è di almeno 0,1 V sopra la linea di base.
18. Rimuovere qualsiasi cantilever che non rispondono dal protocollo di scansione sul software di controllo laser / foto-rivelatore.
19. I cantilever attivi possono quindi essere riesaminati senza stimolazione al fine di ottenere una lettura di spontanea attività contrattile della cellula.
20. Eseguire scansioni con o senza stimolazione elettrica vasto campo, dopo aggiunta di un composto terapeutico al mezzo per osservare il suo effetto sull'uscita funzionale delle cellule in coltura.
21. Effettuare valutazioni fatica stimolando elettricamente le cellule per lunghi periodi e livelli di scansione di contr actility per misurare quanto tempo ci vuole per forza di picco a scendere al di sotto di una determinata soglia.
22. Negli esperimenti in cui i neuroni motori sono mantenuti in co-coltura con il muscolo, misurare la formazione di giunzione neuromuscolare attraverso il trattamento dei motoneuroni-myotube sbalzo co-culture con uno stimolante neuronale (come il glutammato) o inibitore sinaptica (ad esempio, D-tubocurarina) e scansione per aumenti e diminuzioni di attività spontanea, rispettivamente ^16.
23. Eseguire scansioni specifiche dettate dalle esigenze degli esperimenti pianificati.

5 Analisi di sbalzo deflessione dati

1. Usa modificato equazioni di Stoney ¹⁵ (di seguito dettagliate) per convertire i dati cantilever grezzi deflessione (in Volt) in una lettura di stress nello strato di cellule o miotubi (in Pascal), e una misura diretta della forza contrattile cellulare (in nano-newton):
   annuncio / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Equazione 1
   Equazione 2
2. Dove δ = sbalzo punta flessione e lo stress prodotti dalla myotube, σ _c = lo stress prodotto dal myotube, assumendo un film di spessore uniforme l'intera larghezza del cantilever, C _rivelatore = coefficiente specifica del sistema relativa tensione di posizione laser sulla foto -detector, θ = l'angolo del laser e rivelatore rispetto al piano del cantilever, E _Si = modulo elastico di silicio, t _Si = spessori del cantilever, t _f = spessore miotubi, v _Si = coefficiente di veleno silicio, L = lunghezza a sbalzo, lunghezza P = percorso del laser dalla punta a sbalzo a rivelatore, e w _{Si = la larghezza del cantilever. Uno schema che spiega i termini utilizzati in queste equazioni è fornita in Figura 6.}
3. Assumendo il miotubi è un film uniforme, la forza nella miotubi è uguale alla forza del film, portando a equazione 3, uguagliando il calcolo della forza da stress e l'area della sezione trasversale cella assunto che è stato utilizzato per l'applicazione di Stoney di equazione.
   Equazione 3
4. Dopo la raccolta dei dati funzionali, fissare i chip a sbalzo per l'analisi immunocitochimica o utilizzare le celle per proteine ​​o DNA analisi utilizzando tecniche standard.
5. Facoltativamente, tornare le cellule al incubatore invece di preparare per l'analisi molecolare, al fine di rivalutare le prestazioni funzionali in un momento-momento successivo.

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Risultati

Cultura di successo di cellule contrattili su cantilever è una procedura relativamente semplice, utilizzando tecniche standard di coltura cellulare (Figura 5). La percentuale di cellule di supporto cantilever amministrazioni varierà a seconda del tipo di cellula in esame e specifica cultura tecnica impiegata. Utilizzo di cellule embrionali primarie derivate da ratto arti posteriori, l'attività contrattile è stata rilevata il 12% di cantilever esaminati (n = 4). Analisi della funzione contrattile...

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Discussione

Le fasi critiche analizzando cantilever microscala per prove di contrazione cellulare sono il posizionamento del chip a sbalzo all'interno della fase di microscopio, e il successivo allineamento del laser e foto-rivelatore con la punta del cantilever angolari nella matrice. Se questo non viene fatto accuratamente, quindi il software sarà in grado di estrapolare le posizioni dei rimanenti cantilever nella matrice, potenzialmente conseguente accumulo di falsi negativi durante la raccolta dei dati. Gli operatori devon...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ml
Ciliary Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ml
Neurotrophin-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ml
Neurotrophin-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ml
Acidic Fibroblast Growth Factor	Life Technologies	13241-013	25 ng/ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ml
Heparin Sulphate	Sigma	D9809	100 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158	20 ng/ml
Vitronectin	Sigma	V0132	100 ng/ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
Equipment
Class 2 red diode laser	Newport
Photo-detector	Noah Industries
Model 2100 Pulse stimulator	A-M systems
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments
Patch clamp microscope and stage	Olympus
Delta T4 culture dish controller	Bioptechs
Axoscope software	Molecular Devices
LabVIEW software	National Instruments
37 oC, 5% CO2 incubator	NAPCO
Class 2 microbiological flow hood	Labconco
Pipettes and tips	Eppendorf