Utilização de microscópicos de silício Cantilevers para avaliar a função celular contrátil<em&gt; In Vitro</em

Resumo

Este protocolo descreve o uso de braços de suporte de silicone em micro-como as superfícies de cultura maleáveis ​​para a medição da contractilidade de células do músculo in vitro. Contração celular provoca flexão cantilever, que pode ser medido, registrado, e convertido em leituras de força, proporcionando um sistema não invasivo e escalável para medir a função contrátil in vitro.

Resumo

O desenvolvimento de ensaios in vitro preditivos e mais biologicamente relevantes baseia-se o avanço dos sistemas de cultura de células versáteis que facilitam a avaliação funcional das células semeadas. Para esse efeito, a tecnologia cantilever microescala oferece uma plataforma com a qual a medir a funcionalidade contráctil de uma gama de tipos de células, incluindo esquelético, cardíaco e células de músculo liso, através da avaliação da contracção induzida substrato flexão. Aplicação de matrizes cantilever multiplexados fornece os meios para o desenvolvimento moderado a protocolos de alto rendimento para a avaliação da eficácia do fármaco e toxicidade, o fenótipo da doença e progressão, assim como neuromusculares e outras interacções célula-célula. Este manuscrito apresenta pormenores para a fabricação de matrizes de cantiléver fiáveis ​​para este fim, e os métodos necessários para células em cultura com sucesso sobre estas superfícies. Descrição mais detalhada é fornecida sobre as medidas necessárias para realizar anal funcionalysis de tipos de células contrátil mantida em tais matrizes, utilizando um novo sistema de laser e foto-detector. Os dados representativos fornecidos destaca a precisão e a natureza reprodutível da análise da função contráctil possível usar este sistema, bem como a grande variedade de estudos para que tal tecnologia pode ser aplicada. Ampla adoção bem sucedida deste sistema poderia fornecer aos investigadores os meios para realizar estudos de baixo custo rápidas e funcionais in vitro, levando a previsões mais precisas do desempenho do tecido, o desenvolvimento da doença ea resposta ao tratamento terapêutico romance.

Introdução

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades^1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro^3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option^6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models¹¹.

Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells^12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology¹⁴, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection¹⁵. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies^15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.

This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

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Protocolo

1. Cantilever Chip Fabrication

Pormenores ilustrados das etapas de fabricação descritos são proporcionados na Figura 1.

1. Coloque wafers de silício sobre isolante (SOI) em um forno e leve ao forno a 125 ° C por 20 min para desidratar-los.
2. Deposite um 1,5 um espessa camada de óxido de silício na camada alça do wafer SOI desidratado usando um Plasma avançado Chemical Vapor Deposition (PECVD) ferramenta.
3. Coloque a bolacha sobre a rotação do mandril com a camada de revestimento do dispositivo virada para cima. Certifique-se de bolacha é centrado, dispensar 2 ml de P20 iniciador no centro da bolacha, e centrifugação a 3000 rpm durante 60 segundos a uma aceleração de 1000 rpm / seg. P20 primário promove a aderência de material fotosensitivo que a camada do dispositivo.
4. Enquanto a bolacha ainda está no revestidor mandril rotação, dispensar 2 ml de S1818 fotorresistente no centro da bolacha, e centrifugação a 3000 rpm durante 60 segundos a uma aceleração de 1000 rpm / seg para obtain uma camada de 1,5 um de espessura de material fotosensitivo.
5. Coloque a bolacha sobre uma placa quente e realizar um cozimento suave a 115 ° C durante 1 min.
6. Realizar uma exposição UV contato duro usando um contato fotolitografia máscara alinhador, a fim de transferir o padrão da máscara cantilever para o fotorresiste sobre a camada de dispositivo. Calcule o tempo de exposição com base no valor da energia de exposição de 125 mJ / cm ² para S1818 photoresist.
7. Desenvolver o photoresist imergindo o wafer em um 726 MIF desenvolvedor photoresist para 1 min, agitando suavemente o wafer e para trás.
8. Lavar a bolacha com (DI) de água ionizada-de e secá-lo, de preferência, usando um secador de rotação da ferramenta de enxaguamento (SRD).
9. Remover o material fotoresistivo a partir da borda da pastilha (até 5 mm a partir da extremidade), utilizando um cotonete de algodão embebido em acetona.
10. Coloque o wafer em uma ferramenta profunda Reactive Ion Etch (DRIE), com o lado da photoresist voltada para cima, e executar uma receita para gravar a camada de silício modelada através do devicamada ce. As funções da camada de óxido enterrado como uma parada de etch, por isso, realizar uma etch com 50% a 100% mais ciclos do que se espera que seja necessário para garantir a corrosão completa.
11. Coloque a bolacha em uma solução de banho photoresist quente por 20 minutos para retirar o fotorresiste. Transfira a bolacha para uma quick-dump-enxaguadora (QDR) para lavar o wafer com água DI. Após a tira photoresist, coloque o wafer em uma ferramenta SRD para lavar e secar o wafer. Inspecione o wafer sob um microscópio para garantir o padrão cantilever aparece como esperado.
12. Deposite um 1 mícron espessa camada de óxido de silício dopado com un na camada do wafer usando uma ferramenta de PECVD dispositivo. Funções desta camada de óxido como uma camada protetora para as consolas durante mais etapas de processamento.
13. Coloque a bolacha sobre a rotação do mandril com o revestimento de camada punho virada para cima para iniciar o processamento do lado posterior do disco. Certifique-se de bolacha é centrado, dispensar 2 ml de P20 iniciador no centro da bolacha, e centrifugação a 3000 rpmpor 60 segundos a uma aceleração de 1000 rpm / seg.
14. Enquanto a bolacha ainda está no revestidor mandril rotação, dispensar 2 ml de SPR220-4.5 fotorresistência sobre o centro da pastilha, e centrifugação a 2000 rpm durante 45 segundos a uma aceleração de 1000 rpm / seg para se obter um 6,5 uM camada espessa de photoresist.
15. Coloque a bolacha em uma placa quente para efectuar uma aproximação suave cozer a 115 ° C durante 2 min.
16. Usando um fotolitografia contato alinhador capazes de frente / trás alinhamento, alinhar a máscara de janela traseira para o padrão cantilever frente e realizar uma exposição UV contato duro para transferir o padrão da máscara de janela traseira do fotorresiste sobre a camada de alça. Use um tempo de exposição calculado com base no valor da energia de exposição de 480 mJ / cm ² para SPR220-4.5 photoresist.
17. Após a exposição à radiação UV, deixar as bolachas permanecer numa área escura durante 30 minutos antes do próximo passo de processamento.
18. Desenvolver o fotorresistente por imersão a bolacha emum desenvolvedor 726 MIF photoresist por 2 min, agitando suavemente o wafer e para trás.
19. Lavar a bolacha com (DI) de água ionizada-de e secá-lo, de preferência, usando um secador de rotação da ferramenta de enxaguamento (SRD).
20. Coloque as bolachas em uma estufa a 90 ° C durante 12 hr.
21. Etch a camada de óxido de silício sobre a parte traseira da bolacha usando um sistema de RIE com gases fluorados e uma receita para gravar óxido. O óxido modelado na parte traseira da pastilha actua como uma máscara de corrosão para o tratamento posterior. Inspeccionar as bolachas sob um microscópio para assegurar que o óxido de silício na janela é exposta completamente gravado.
22. Remover o material fotoresistivo sobre a borda da pastilha (até 5 mm a partir da extremidade), utilizando um cotonete de sala limpo embebido em acetona.
23. Coloque a bolacha numa ferramenta com DRIE e executar uma receita para gravar a camada de alça modelada a uma profundidade de 500 mm com o funcionamento enterrado camada de óxido como um batente de corrosão. Dividir este etch em várias execuções para evitar um aquecimento excessivo dabolacha, que provoca corrosão inconsistente do silício. Esta etapa etch remove completamente o silício por baixo das consolas.
24. Executar um passo de ataque químico húmido utilizando 25% de produto corrosivo HF diluído, para retirar a camada de óxido enterrado abaixo dos braços de suporte e a camada de óxido de protecção na parte superior dos braços de suporte.
    NOTA: Este passo liberta a superfície de fundo dos braços de suporte de silício e também abre uma janela de baixo para fornecer um acesso para sondar o cantilever com o laser.
25. Lavar a bolacha usando uma série de banhos de água DI e cuidadosamente seca com azoto. Uma vez que os cantilevers são suportados apenas em suas bases, não use sprays fortes de água DI ou gás inerte directamente nas consolas.
26. Clivar as fichas individuais a partir da bolacha com as linhas clivam produzidos durante o passo de pega camada de corrosão.

Cultura 2. celular

1. Prepare 13F lamelas de acordo com métodos previamente publicados ^17.
   NOTA: Se 13F enseadarslips não estão disponíveis, qualquer superfície hidrofóbica com um ângulo de contacto acima de 95 ° pode ser usado.
2. Esterilizar fichas cantilever e 13F lamelas numa solução de etanol a 70% e deixar secar ao ar numa câmara de fluxo.
3. Coloque fichas cantilever individuais no alto de 13F lamelas dentro de um padrão de 12 poços.
4. Revestir as consolas com o biopolímero ou modificação superficial optimizada para o tipo de célula a ser utilizado de acordo com os protocolos de cultura de células padrão.
5. Re-suspender as células no seu meio de crescimento específica para a concentração desejada.
   NOTA: Este protocolo resulta em um grande número de células que caem através da janela do cantilever e que não aderem à superfície cantilever desejado. Preparações de células deve, portanto, ser feita 3-4x mais concentrado do que para os preparativos lamela normal. Por exemplo, a sementeira de células satélites do músculo esquelético de rato é tipicamente levada a cabo usando uma densidade de sementeira de aproximadamente 500 a 700 células / mm quadrado ^15,16, E são utilizados com substratos cantilever a 2.000 células / mm quadrado. Experiências de optimização deve ser levada a cabo com as novas fontes de células para determinar uma densidade de sementeira apropriada.
6. Pipete 200 pi da suspensão de células sobre a superfície do chip de cantilever, garantindo a bolha de forma cobre as janelas totalmente cantilever. Se o meio de mechas através da janela e não forma uma bolha estática na parte superior dos braços de suporte substituir a lamela 13F e Reattempt o chapeamento.
7. Transferir a placa contendo as fichas para uma incubadora e permitir que as células a aderir durante pelo menos 1 hora (preferencialmente 2-3 h).
8. Após este período de chapeamento, utilizar uma pinça estéril para transferir o chip a um bem limpo, sem uma lamela 13F, e superior a cultura com 1 ml de meio de crescimento.
9. Retorne a placa para a incubadora.
10. Manter as células de acordo com o seu protocolo padrão para a manutenção in vitro em lamelas. Para as células de músculo esquelético,um interruptor de composição do meio que induz a formação de miotubo uma vez as células se tornavam confluentes será necessário.

3 Configuração de Hardware e Software de Análise cantilever deflexão

1. Coloque um prato de cultura para a fase de aquecimento de um microscópio vertical electrofisiologia.
2. Adicionar 3 ml do meio de alimentação das células encontra-se suspensa em (+ HEPES 10 mM) para a fase de microscópio aquecida.
3. Montar os eléctrodos de aço inoxidável sobre o interior da placa de cultura aquecido a uma distância de 15 mm, e ligá-los a um gerador de impulsos, capaz de produzir impulsos de estimulação do campo de intensidade variável, da frequência e da forma de onda, para permitir que o sistema para produzir estimulação do campo de células, quando apropriado.
4. Parafuso de um laser de hélio-néon, montado em fases de translação XY, para o lado de baixo da mesa de microscópio e ajustá-lo de modo que o feixe de laser é dirigida através da base do prato de cultura aquecido a um ângulo de 30 ° relativE para o plano do cantilever.
5. Tranque um módulo fotodetector quadrante, montado em estágios de translação XY, ao lado de baixo do palco microscópio e ajustar a posição para que as terras de feixe de laser refletido no centro dos quatro quadrantes. Figura 2 apresenta uma visão geral da configuração do hardware necessário para a implementação do protocolo descrito.
6. Escreva um programa de software para controlar os atuadores lineares que fazem a varredura através das consolas. Escrever o programa de software, com referência ao diagrama de fluxo representado na Figura 3. A interface gráfica programado para utilização com este sistema é fornecida na Figura 4.

4 Gravação cantilever deflexão de dados

1. Ligue o hardware e software de análise cantilever associado.
2. Insira o termistor fase aquecida para o meio e esperar por ele para ler 37 ° C.
3. Insira o chip cantilever no palco com a cantilevers voltadas para o lado direito do palco.
4. Ligue a fonte de luz do microscópio.
5. Concentre o microscópio para trazer as extremidades dos braços de suporte em vista e usar o software de controlo do laser / foto-detector para posicionar o feixe de laser na extremidade do braço de suporte 1 NOTA: Assumindo que os braços de suporte estão orientadas para a direita do palco, um cantilever é aquele posicionado no canto superior esquerdo da matriz e os números de correr para 16 no canto inferior esquerdo. Cantilever 17 está na posição superior direito e é executado a 32 na parte inferior direita (Figura 5A).
6. Pressione o botão "Play" no software de gravação.
7. Posicione a foto-detector para que o sinal lê "0" em ambos x e y quadros, ajustando os motores de passo que controlam o fotodetector.
8. Jogo 1 em cantilever posição no software de controlo do laser / fotodetector (Figura 4).
9. Mova o laser até a ponta do cantilever 16, repita o passo 4.7., E definir cantilever 16 posição no software de controle do laser / foto-detector.
10. Mova o laser até a ponta do cantilever 32, repita o passo 4.7., E definir cantilever 32 posição no software de controle do laser / foto-detector.
11. Mova o laser até a ponta do cantilever 17, repita o passo 4.7., E definir cantilever 17 posição no software de controle do laser / foto-detector.
12. Desligue a fonte de luz do microscópio e a luz do teto no laboratório.
13. Pressione o botão "record" no software de gravação.
14. Defina o hardware gerador de pulso de 40 ms, 5 V pulsos com uma frequência de 1 Hz, e ligar a máquina.
    NOTA: Opcionalmente, empregam protocolos de estimulação otimizadas para fontes de células específicas, neste ponto, as definições indicados são orientações baseadas em dados coletados através de fontes humanas e células de roedores ^12,13,15,16.
15. Usando o software de controle do laser / fotodetector, definir o hardware para fazer a varredura em toda a matriz de 32 cantilever, parando por 5 segundos a cada um eme.
16. Quando a digitalização dos 32 consolas está completa, desligue o estimulador, em seguida, parar o software de gravação e abrir o arquivo de dados.
17. Examine o rastreamento gravado a partir de cada cantilever para a evidência de atividade contrátil. Tome nota de cada cantilever com respostas positivas. A contracção é definido como um pico se a deformação é, pelo menos, 0,1 V, acima da linha de base.
18. Remova todos os cantilevers não-responsivos a partir do protocolo de digitalização no software de controle do laser / foto-detector.
19. As consolas activas podem então ser varrida novamente, sem estimulação, a fim de obter uma leitura da actividade contráctil espontânea da célula.
20. Varreduras executado com ou sem campo amplo estimulação eléctrica, a seguir à adição de um composto terapêutico para o meio, a fim de observar o seu efeito sobre a saída funcional das células cultivadas.
21. Realizar avaliação de fadiga ao estimular eletricamente as células por longos períodos e níveis de análise de contr actility para medir quanto tempo leva para o pico de força para cair abaixo de um limite específico.
22. Em experimentos onde os neurônios motores são mantidos em co-cultura com o músculo, medir a formação junção neuromuscular através de um tratamento de motoneuron-miotubo cantilever co-culturas com um estimulante neuronal (como o glutamato) ou inibidor sináptico (por exemplo, D-tubocurarina) e digitalização para aumentos e reduções na atividade espontânea, respectivamente ^16.
23. Realizar exames específicos como ditado pelas necessidades dos experimentos planejados.

5 Análise de Dados cantilever deflexão

1. Utilização modificado equações de Stoney ¹⁵ (descrito abaixo) para converter os dados da linha suspensa em bruto de deflexão (em volts) em um visor de tensão na camada de células ou miotubos (em Pascal), e uma medição directa da força contráctil celular (em nano-Newtons):
   ad / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Equação 1
   Equação 2
2. Onde δ = cantilever ponta tensões de deflexão e produzido pela miotubo, σ _c = tensão produzida pelo miotubo, assumindo um filme de espessura uniforme a toda a largura do braço de suporte, C = o coeficiente de _detector específico do sistema de tensão relativa à posição do laser sobre a foto -detector, θ = o ângulo do laser e do detector em relação ao plano do cantilever, _Si = E o módulo de elasticidade de silício, _Si = t a espessura do braço de suporte, t _f = espessura miotubo, v = proporção de _Si de veneno silício, L = comprimento do cantilever, comprimento P = caminho do laser de ponta cantilever ao detector, e w _{Si = a largura do cantilever. Um diagrama esquemático que explica os termos utilizados nessas equações é fornecido na Figura 6.}
3. Assumindo que o miotubo é um filme uniforme, a força no miotubo é igual à força no filme, levando a Equação 3, igualando o cálculo da força de tensão e área de secção do cruzamento célula assumiu que foi utilizado para a aplicação de Stoney de equação.
   Equação 3
4. Após a coleta de dados funcionais, corrigir fichas cantilever para análise imunocitoquímica ou utilizar células de proteína ou DNA análise usando técnicas convencionais.
5. Opcionalmente, as células voltem para a incubadora, em vez de se preparar para a análise molecular, a fim de reavaliar o desempenho funcional em um momento posterior de ponto.

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Resultados

Cultura bem sucedida de células contrácteis em cantiléver é um procedimento relativamente simples, utilizando técnicas padrão de cultura de células (Figura 5). A percentagem de consolas de apoio células contratantes irá variar dependendo do tipo de célula que está sendo examinado e técnica de cultura específica empregada. Usando células embrionárias primárias derivadas de rato membros posteriores, actividade contráctil foi detectada em 12% das consolas analisados ​​(n = 4). Análise...

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Discussão

Os passos críticos na análise de microescala consolas para a evidência de contracção celular são o posicionamento do braço de suporte do chip dentro da platina do microscópio e do subsequente alinhamento do laser e foto-detector, com a ponta dos braços de suporte de canto na matriz. Se isso não for feito de forma precisa, em seguida, o software não será capaz de extrapolar as posições das restantes consolas na matriz, potencialmente levando ao acúmulo de falsos negativos durante a coleta de dados. Os oper...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ml
Ciliary Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ml
Neurotrophin-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ml
Neurotrophin-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ml
Acidic Fibroblast Growth Factor	Life Technologies	13241-013	25 ng/ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ml
Heparin Sulphate	Sigma	D9809	100 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158	20 ng/ml
Vitronectin	Sigma	V0132	100 ng/ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
Equipment
Class 2 red diode laser	Newport
Photo-detector	Noah Industries
Model 2100 Pulse stimulator	A-M systems
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments
Patch clamp microscope and stage	Olympus
Delta T4 culture dish controller	Bioptechs
Axoscope software	Molecular Devices
LabVIEW software	National Instruments
37 oC, 5% CO2 incubator	NAPCO
Class 2 microbiological flow hood	Labconco
Pipettes and tips	Eppendorf