ניצול של זיזי סיליקון המיקרוסקופים כדי להעריך את התפקוד נייד התכווצות<em&gt; במבחנה</em

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בזיזי סיליקון microscale כמשטחי תרבות גמישים למדידת ההתכווצות של תאי שריר במבחנה. התכווצות סלולרית גורמת לכיפוף שלוחה, הניתן למדידה, נרשם, והוסב לקריאות כוח, מתן מערכת לא פולשנית וניתן להרחבה למדידת תפקוד התכווצות במבחנה.

Abstract

הפיתוח של מבחני חוץ גופייה יותר חזוי ורלוונטיים מבחינה ביולוגית מתבסס על קידום מערכות תרבית תאים צדדי המאפשרות הערכה התפקודית של תאי זרע. לשם כך, טכנולוגית שלוחה microscale מציעה פלטפורמה שבה למדוד את הפונקציונליות ההתכווצות של מגוון רחב של סוגי תאים, כוללים שלד, לב, ותאי שריר חלק, דרך הערכת מצע התכווצות מושרה כיפוף. יישום של מערכי שלוחה ריבוב מספק את האמצעים לפיתוח מתון לפרוטוקולי תפוקה גבוהה להערכת יעילות תרופה ורעילות, פנוטיפ מחלה והתקדמות, כמו גם יחסי גומלין תוקפת ותאי תאים אחרים. כתב יד זה מספק פרטים עבור בודה מערכי שלוחה אמינות למטרה זו, ושיטות הנדרשות להצלחת תאי תרבות על משטחים אלה. תיאור נוסף מסופק על הצעדים דרושים כדי לבצע אנאלי פונקציונלייסיס של סוגי תאי התכווצות שמר על מערכים כאלה באמצעות מערכת פוטו וגלאי לייזר ורומן. נתוני הנציג סיפקו רגעי שיא הדיוק והטבע לשחזור של הניתוח של פונקצית התכווצות אפשרית באמצעות מערכת זו, כמו גם מגוון הרחב של מחקרים שלטכנולוגיה כזו יכולה להיות מיושמת. אימוץ נרחב מוצלח של מערכת זו יכול לספק לחוקרים את האמצעים לבצע מחקרים תפקודיים מהירים, עלות נמוכה במבחנה, שמוביל לתחזיות מדויקות יותר של ביצועי רקמות, התפתחות מחלה ותגובה לטיפול טיפולי חדשני.

Introduction

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades^1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro^3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option^6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models¹¹.

Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells^12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology¹⁴, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection¹⁵. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies^15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.

This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ייצור .1 צ'יפ קונסוליים

פרטים בתמונות של שלבי הייצור המתוארים ניתנים באיור 1.

1. הנח הסיליקון על מבודד (SOI) הוופלים בתנור ואופה ב125 ° C עבור 20 דקות לייבש אותם.
2. להפקיד 1.5 מיקרומטר שכבה עבה של תחמוצת סיליקון על גבי שכבת הידית של רקיק SOI מיובש באמצעות פלזמה משופרת כימי החמקן הפקדת כלי (PECVD).
3. מניחים את פרוסות על צ'אק coater הספין עם שכבת המכשיר פונה כלפי מעלה. ודא רקיק מרוכז, לוותר 2 מ"ל של פריימר P20 במרכז של פרוסות סיליקון, והספין ב3,000 סל"ד 60 שניות בהאצה של 1,000 סל"ד / sec. פריימר P20 מקדם את ההידבקות של photoresist לשכבת המכשיר.
4. בעוד ופל עדיין על צ'אק coater הספין, לוותר 2 מ"ל של photoresist S1818 על המרכז של פרוסות סיליקון, וספין ב3,000 סל"ד 60 שניות בהאצה של 1,000 סל"ד / sec לobtain 1.5 מיקרומטר שכבה עבה של photoresist.
5. מניחים את פרוסות על פלטה חשמלית ולבצע לאפות רך ב115 מעלות צלזיוס במשך דקות 1.
6. לבצע חשיפה לקרינת UV המגע קשה באמצעות aligner מסכת קשר photolithography כדי להעביר את התבנית ממסכת שלוחה לphotoresist על שכבת המכשיר. לחשב את זמן חשיפה המבוסס על ערך אנרגיית חשיפה של 125 mJ / ² סנטימטר לphotoresist S1818.
7. לפתח את photoresist ידי טבילת הרקיק במפתח photoresist MIF 726 ל1 דקות בזמן שרעד בעדינות הרקיק הלוך ושוב.
8. יש לשטוף את הרקיק עם מים מיוננים דה (DI) ולייבש אותו, רצוי בעזרת כלי מייבש שטיפת ספין (SRD).
9. הסר את photoresist מהקצה של פרוסות סיליקון (עד 5 מ"מ מהקצה) באמצעות מקלון צמר גפן טבול באצטון.
10. טען את הרקיק בכלי עמוק הריאקטיבי יון Etch (DRIE), עם צד photoresist פונה כלפי מעלה, ולהפעיל מתכון כדי לחרוט את שכבת סיליקון בדוגמת דרך דווישכבת ce. פונקציות שכבת תחמוצת נקברו כתחנה לחרוט, כך לבצע לחרוט עם 50% ל100% יותר מחזורים מאשר צפויה להיות נחוץ כדי להבטיח לחרוט מלא.
11. מניחים את פרוסות בפתרון אמבטיה photoresist חם עבור 20 דקות להפשיט photoresist. העבר את פרוסות ל- dump-rinser מהיר (QDR) כדי לשטוף את הרקיק עם מים די. בעקבות רצועת photoresist, לטעון את הרקיק בכלי SRD לשטוף ולייבש את פרוסות סיליקון. בדוק את הרקיק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את דפוס שלוחה מופיע כצפוי.
12. להפקיד שכבה עבה 1 מיקרומטר תחמוצת סיליקון מסומם האו"ם על שכבת המכשיר של פרוסות סיליקון באמצעות כלי PECVD. פונקציות שכבת תחמוצת זו כשכבת הגנה לזיזים בשלבי עיבוד נוספים.
13. מניחים את פרוסות על צ'אק coater הספין עם שכבת הידית כלפי מעלה כדי להתחיל עיבוד של הצד האחורי של פרוסות סיליקון. ודא רקיק מרוכז, לוותר 2 מ"ל של פריימר P20 במרכז של פרוסות סיליקון, וספין ב3,000 סל"דל60 שניות בהאצה של 1,000 סל"ד / sec.
14. בעוד ופל עדיין על צ'אק coater הספין, לוותר 2 מ"ל של photoresist SPR220-4.5 על המרכז של פרוסות סיליקון, והספין ב2,000 סל"ד 45 שניות בהאצה של 1,000 סל"ד / sec להשיג 6.5 מיקרומטר שכבה עבה של photoresist.
15. מניחים את פרוסות על צלחת חמה קרבה לבצע לאפות רך ב115 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
16. באמצעות aligner קשר photolithography מסוגל קדמי / אחורי יישור, ליישר את מסכת החלון האחורי לדפוס שלוחה הצד הקדמי ולבצע חשיפה לקרינת UV מגע קשה כדי להעביר את התבנית מהחלון האחורי המסכה photoresist על שכבת הידית. השתמש בזמן חשיפה מחושב על בסיס ערך אנרגיית חשיפה של 480 mJ / ² סנטימטר לphotoresist SPR220-4.5.
17. לאחר חשיפה לקרינת UV, בואו הוופלים להישאר באזור חשוך למשך 30 דקות לפני שלב העיבוד הבא.
18. לפתח את photoresist ידי טבילת הרקיק ביזם 726 photoresist MIF למשך 2 דקות תוך טלטול הרקיק בעדינות קדימה ואחורה.
19. יש לשטוף את הרקיק עם מים מיוננים דה (DI) ולייבש אותו, רצוי בעזרת כלי מייבש שטיפת ספין (SRD).
20. מניחים את הפרוסות בתנור על 90 מעלות צלזיוס במשך שעה 12.
21. לחרוט את שכבת תחמוצת סיליקון בישבן של הרקיק באמצעות מערכת ורי עם גזי פלואור ומתכון לתחריט תחמוצת. תחמוצת הדוגמת על הישבן של פרוסות סיליקון פועלת כמסכה לחרוט לעיבוד נוסף. בדוק את הוופלים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שתחמוצת סיליקון בחלון החשוף היא חרוטה לחלוטין.
22. הסר את photoresist על קצה הרקיק (עד 5 מ"מ מהקצה) באמצעות ספוגית חדר נקייה הטבולה באצטון.
23. טען את הרקיק בכלי DRIE עם ולהפעיל מתכון כדי לחרוט את שכבת ידית בדוגמת לעומק של 500 מיקרומטר עם תפקוד שכבת תחמוצת נקבר כתחנה לחרוט. פיצול לחרוט זה לריצות מרובות כדי למנוע חימום יתר שלרקיק, מה שגורם לתחריט עולה בקנה אחד של סיליקון. צעד לחרוט זה מסיר לחלוטין את הסיליקון שמתחת הזיזים.
24. לבצע צעד תחריט רטוב באמצעות 25% etchant HF לדלל, להפשיט את שכבת תחמוצת נקברה מתחת לזיזים ושכבת תחמוצת המגן על גבי הזיזים.
    הערה: שלב זה משחרר את המשטח התחתון של זיזי סיליקון וגם פותח חלון מתחת לספק גישה לחקור שלוחה עם הלייזר.
25. יש לשטוף את הרקיק באמצעות סדרה של אמבטיות מים די ויבשה בזהירות עם חנקן. מאז הזיזים נתמכים רק בבסיסים שלהם, לא משתמש בתרסיסים בכוח של מים די או גז אינרטי ישירות על הזיזים.
26. קליב השבבים הבודדים מהרקיק לאורך הקווים ידבקו הופקו במהלך השלב לחרוט שכבת ידית.

תרבות .2 סלולארי

1. הכן 13F coverslips על פי שיטות שפורסמו בעבר ^17.
   הערה: אם מפרצון 13Frslips אינו זמין, ניתן להשתמש בכל משטח הידרופובי עם זווית מגע מעל 95 מעלות.
2. לעקר שבבי שלוחה ו13F coverslips בפתרון אתנול 70% ולאפשר לאוויר יבש בזרימה מכסה המנוע.
3. הנח שבבי שלוחה בודדים על גבי 13F coverslips בתוך צלחת יפה סטנדרטית 12.
4. מעיל הזיזים עם שינוי biopolymer או משטח מותאם לסוג התא בשימוש על פי פרוטוקולי תרבית תאים סטנדרטיים.
5. מחדש להשעות את התאים במדיום הגידול הספציפי שלהם לריכוז הרצוי.
   הערה: פרוטוקול זה יגרום למספר לא מבוטל של תאים נופלים דרך חלון שלוחה ולא שמירה על פני השטח שלוחה הרצויות. הכנות תא לכן צריכים להיעשות 3-4x מרוכזת יותר מאשר להכנות coverslip סטנדרטיים. לדוגמא, זריעה של תאי לווין בשרירי שלד חולדה מתבצעת בדרך כלל באמצעות צפיפות זריעה של 500-700 תאים / כיכר מ"מ ^15,16, ונמצא בשימוש במצעי שלוחה ב2,000 תאים / מ"מ מרובע. צריכים להתבצע ניסויי אופטימיזציה עם מקורות סלולריים חדשים כדי לוודא צפיפות זריעה מתאימה.
6. פיפטה 200 μl של ההשעיה התא על גבי משטח שבב שלוחה, הבטחת הבועה של מדיום מכסה את חלונות שלוחה לחלוטין. אם מדיום פתילות דרך החלון ולא ליצור בועת סטטי על גבי הזיזים להחליף coverslip 13F וreattempt הציפוי.
7. העבר את הצלחת המכילה את השבבים לחממה ולאפשר לתאים לדבוק במשך שעה לפחות 1 (רצוי 2-3 hr).
8. לאחר תקופה ציפוי זה, להשתמש במלקחיים סטריליות להעביר את השבב ולנקי, ללא coverslip 13F, ועליון את התרבות עם 1 מ"ל של מדיום גידול.
9. להחזיר את הצלחת לחממה.
10. שמור על תאים על פי הפרוטוקול הסטנדרטי שלהם לתחזוקה במבחנה על coverslips. לתאים שרירי שלד,מתג של הרכב בינוני לגרום להיווצרות myotube פעם התאים הופכים מחוברות תהיה צורך.

.3 התקנה של חומרה ותוכנה לניתוח תומכת הסטה

1. מניחים צלחת תרבות מחוממת לבמה של מיקרוסקופ אלקטרופיזיולוגיה זקוף.
2. הוסף 3 מ"ל של מדיום האכלת התאים כרגע מושעים ב( + 10 HEPES מ"מ) לבמה מיקרוסקופ המחוממת.
3. הר אלקטרודות נירוסטה בחלק הפנימי של צלחת התרבות המחוממת במרחק הפרדת 15 מ"מ ולחבר אותם לגנרטור דופק, מסוגל לייצר פולסים גירוי תחום העצמה משתנות, תדירות, וצורת הגל, כדי לאפשר למערכת כדי לייצר גירוי שדה של תאים בעת צורך.
4. בורג לייזר הליום ניאון, רכוב על שלבי translational XY, לחלק התחתון של טבלת מיקרוסקופ ולהתאים אותו כך שקרן הלייזר מכוונת דרך הבסיס של המנה התרבות המחוממת בrelativ 30 מעלות זוויתדואר למטוס של שלוחה.
5. בורג מודול צילום גלאי רבע, רכוב על שלבי translational XY, לחלק התחתון של הבמה מיקרוסקופ ולהתאים את המיקום, כך שאדמות קרן הלייזר משתקפות במרכז 4 הרביעים. איור 2 מספק סקירה של החומרה להגדיר הכרחי ליישום הפרוטוקול המתואר.
6. לכתוב תוכנה כדי לשלוט על המפעילים ליניארי שלסרוק פני הזיזים. לכתוב תוכנה תוך התייחסות לתרשים הזרימה הניתן באיור 3. הממשק הגרפי המתוכנתים לשימוש עם מערכת זו מסופק באיור 4.

.4 הקלטת תומכת הסטת נתונים

1. הפעל את חומרת ניתוח שלוחה והתוכנה נלווית.
2. הכנס את תרמיסטור הבמה המחומם לתוך המדיום ולחכות שזה לקרוא 37 מעלות צלזיוס.
3. הכנס את שבב שלוחה לבמה עם cantilevers אוריינטציה לכיוון הצד הימני של הבמה.
4. הפעל את מקור מיקרוסקופ האור.
5. פוקוס מיקרוסקופ כדי להביא את הקצוות של הזיזים לעין ולהשתמש בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי למצב את קרן הלייזר על קצה הערה 1 שלוחה: בהנחת הזיזים מכוונת לזכותו של השלב, שלוחה 1 הוא אחד ממוקם בפינה השמאלית העליונה של המערך ומספרים לרוץ למטה ל16 בפינה השמאלית התחתונה. שלוחה 17 היא בעמדה הימנית העליונה ופועלת ל32 בפינה הימנית תחתונה (איור 5 א).
6. לחץ על "לשחק" בתוכנת הצריבה.
7. מקם את התמונה-הגלאי כך שהאות כתוב "0" בשני x ומסגרות y על ידי התאמת מנועי צעד השליטה צילום הגלאי.
8. עמדה להגדיר שלוחה 1 בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי (איור 4).
9. הזז את הלייזר לקצה שלוחה 16, חזור על שלב 4.7., ולהגדיר cantilevאה 16 עמדה בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי.
10. הזז את הלייזר לקצה שלוחה 32, חזור על שלב 4.7., ומיקום שנקבע שלוחה 32 בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי.
11. הזז את הלייזר לקצה שלוחה 17, חזור על שלב 4.7., ומיקום שנקבע שלוחה 17 בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי.
12. כבה את מקור מיקרוסקופ אור ואת האור במעבדה.
13. "שיא" לחץ על תוכנת הצריבה.
14. הגדר את מחולל דופק חומרת 40 אלפיות שניים, 5 V פולסים בתדר של 1 הרץ, והדלק את המכשיר.
    הערה: לחלופין, להעסיק פרוטוקולי גירוי מותאמים למקורות תא מסוימים בשלב זה, את ההגדרות האמורות הן הנחיות מבוססות על נתונים שנאספו באמצעות מקורות ^12,13,15,16 אדם ותא מכרסמים.
15. שימוש בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי, להגדיר את החומרה כדי לסרוק פני מערך 32 שלוחה, לעצור למשך 5 שניות בכל אחד עלדואר.
16. כאשר הסריקה של 32 הזיזים היא מלאה, לכבות את ממריץ, אז לעצור את תוכנת ההקלטה ולהעלות את קובץ הנתונים.
17. לבחון את העקבות שנרשמו מכל שלוחה לראיות לפעילות התכווצות. רשום לעצמך כל שלוחה עם תגובות חיוביות. התכווצות מוגדרת כשיא אם הסטייה היא לפחות 0.1 V מעל קו הבסיס.
18. הסר את כל זיזים שאינם מגיבים מפרוטוקול הסריקה בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי.
19. אז יכולים להיות ייסרקו הזיזים הפעילים ללא גירוי כדי לקבל קריאה של פעילות ההתכווצות הספונטנית של התא.
20. הפעל סריקות עם או בלי גירוי חשמלי שדה רחב, הבאים תוספת של מתחם טיפולי למדיום כדי לצפות את השפעתה על הפלט הפונקציונלי של התאים בתרבית.
21. לבצע הערכות עייפות על ידי גירוי חשמלי של התאים לפרקי זמן ארוכים ורמות סריקה של contr actility למדוד כמה זמן לוקח לשיא כוח לרדת מתחת לסף מסוים.
22. בניסויים שבם הנוירונים מוטוריים נשמרים בשיתוף התרבות עם שרירים, למדוד היווצרות neuromuscular צומת דרך טיפול של שיתוף תרבויות שלוחה motoneuron-myotube עם ממריץ עצבי (כגון גלוטמט) או מעכב הסינפטי (למשל, D-tubocurarine) וסריקה ל עליות וירידות בפעילות ספונטנית בהתאמה ^16.
23. לבצע סריקות ספציפיות כפי שהוכתב על ידי הצרכים של הניסויים המתוכננים.

.5 ניתוח של תומכת הסטת נתונים

1. השימוש הותאם המשוואות של Stoney ¹⁵ (שתפורטנה להלן) כדי להמיר את נתוני סטיית שלוחה גלם (בוולט) לקריאה של מתח בשכבת התאים או myotube (בפסקל), ומדידה ישירה של כוח התכווצות סלולארי (בננו ניוטון):
   מודעה / 51,866 / 51866eq1.jpg "/> משוואת 1
   משוואה 2
2. איפה δ = סטיית קצה שלוחה ולחץ המיוצרים על ידי myotube, σ _c = מיוצר על ידי myotube לחץ, בהנחת סרט עבה אחיד לכל הרוחב של שלוחה, _גלאי C = מקדם המערכת ספציפית הנוגעים במתח לעמדת לייזר על התמונה -detector, θ = הזווית של הלייזר וגלאי ביחס למישור של שלוחה, E _Si = מודולוס האלסטיות של סיליקון, _Si t = העובי של שלוחה, _ד = עובי myotube, _Si v = היחס של הרעל של סיליקון, L = אורך שלוחה, אורך P = דרכו של לייזר מקצה שלוחה לגלאי, וw _{Si = הרוחב של שלוחה. סכמטי המסביר את המונחים המקובלים במשוואות אלה מסופק באיור 6.}
3. בהנחת myotube הוא סרט אחיד, הכוח בmyotube שווה לכח בסרט, שמוביל למשוואת 3, על ידי שהשווה את החישוב של כוח מלחץ ואזור חתך רוחב תא להניח ששימש ליישום של Stoney של משוואה.
   משוואה 3
4. בעקבות איסוף נתונים תפקודי, לתקן שבבי שלוחה לניתוח immunocytochemical או לנצל תאים לניתוח חלבונים או DNA תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית.
5. לחלופין, להחזיר את התאים לחממה במקום להתכונן לניתוח מולקולרי כדי להעריך מחדש את הביצועים פונקציונליים בנקודת זמן מאוחרת יותר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תרבות המוצלחת של תאי התכווצות בזיזים היא הליך פשוט יחסית, תוך שימוש בטכניקות תרבית תאים סטנדרטיים (איור 5). אחוז זיזי תמיכה תאי הידבקות ישתנה בהתאם לסוג תא שנבחן וטכניקת תרבות מסוימת המועסקת. שימוש בתאים עובריים ראשוניים נבעו מגפיים אחוריות עכברוש, פעילות הה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השלבים הקריטיים בניתוח זיזים מיקרוסקופים לראיות של התכווצות סלולרית הם המיקום של שבב שלוחה בתוך הבמה מיקרוסקופ, והיישור הבא של הלייזר וצילום גלאי עם הקצה של זיזי הפינה במערך. אם זה לא נעשה באופן מדויק, ולאחר מכן את התוכנה לא תוכל להסיק את עמדותיהם של הזיזים שנותרו במ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ml
Ciliary Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ml
Neurotrophin-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ml
Neurotrophin-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ml
Acidic Fibroblast Growth Factor	Life Technologies	13241-013	25 ng/ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ml
Heparin Sulphate	Sigma	D9809	100 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158	20 ng/ml
Vitronectin	Sigma	V0132	100 ng/ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
Equipment
Class 2 red diode laser	Newport
Photo-detector	Noah Industries
Model 2100 Pulse stimulator	A-M systems
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments
Patch clamp microscope and stage	Olympus
Delta T4 culture dish controller	Bioptechs
Axoscope software	Molecular Devices
LabVIEW software	National Instruments
37 oC, 5% CO2 incubator	NAPCO
Class 2 microbiological flow hood	Labconco
Pipettes and tips	Eppendorf