微型硅悬臂梁的利用率，评估细胞收缩功能<em&gt;在体外</em

摘要

这个协议描述了用于测量肌肉细胞的收缩力在体外使用的微型硅悬臂梁的柔韧培养表面。细胞收缩引起悬臂弯曲，可以测量，记录和转换成力读数，用于测量收缩功能的体外提供一种非侵入性和可扩展的系统。

摘要

的多个预测和生物相关的体外测定法的发展的前提是多功能的细胞培养系统，促进种子细胞的功能评价的进步。为此，微型悬臂技术提供了一个平台，用以测量各种细胞类型，包括骨骼，心脏和平滑肌细胞的收缩的功能，通过收缩引起的基板弯曲的评估。复用的悬臂阵列的应用提供了一种方式来开发中等至高通量的协议，以评估药物疗效和毒性，疾病的表型和进展，以及神经肌肉和其他细胞 - 细胞相互作用。该原稿提供的信息用于制造可靠的悬臂阵列用于此目的，并且需要在这些表面上成功地培养细胞的方法。设置在需要进行官能肛门的步骤进一步描述收缩的细胞类型ysis保持上使用一种新的激光和光检测系统的这种阵列。到这样的技术可以应用于提供亮点的精度和收缩功能可以利用本系统的分析的可再现性的有代表性的数据，以及在广泛的研究。成功的广泛采用该系统的能提供研究者的手段来在体外进行快速，低成本的功能性研究，导致了组织的性能，疾病发展和响应于新的治疗治疗更准确的预测。

引言

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades^1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro^3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option^6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models¹¹.

Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells^12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology¹⁴, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection¹⁵. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies^15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.

This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

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研究方案

1，悬臂式芯片制造

在图1中提供了所描述的制造步骤示出的细节。

1. 放置上的硅绝缘体（SOI）晶片在烘箱中烘在125℃下进行20分钟至脱水它们。
2. 淀积1.5微米厚的氧化硅层上，用等离子的脱水SOI晶片的把手层增​​强的化学气相沉积（PECVD）的工具。
3. 放置在旋涂机卡盘与装置层朝上的晶片。确保晶片的中心，取2毫升P20引物上的中心晶片，并旋转以3,000 rpm离心60秒以1000转数/秒的加速度。 P20引物促进光致抗蚀剂的器件层的密合性。
4. 而晶片仍然在旋涂机夹头，分配2毫升S1818光致抗蚀剂，在晶片的中心，和旋转的转数3000rpm，60秒，在1000转/秒的加速度与邻btain 1.5微米厚的光刻胶层。
5. 放置在晶片上的热板上，并持续1分钟进行软烤115℃。
6. 为了从悬臂掩模将图案转移到光致抗蚀剂的器件层上执行使用光刻接触掩模对准器的硬接触UV曝光。计算的基础上的125毫焦/厘米²的S1818光致抗蚀剂的曝光能量值的曝光时间。
7. 浸在726 MIF光刻胶显影剂晶片1分钟同时轻轻摇动晶片来回开发的光致抗蚀剂。
8. 用去离子水（DI）晶片与擦干，最好使用旋转清洗机（SRD）的工具。
9. 除去从晶片的边缘的光致抗蚀剂（最多5毫米的边缘）用棉棒蘸丙酮。
10. 装入晶片的深反应离子刻蚀（DRIE）工具，具有光致抗蚀剂面朝上，并运行一个配方通过德维蚀刻图案化硅层策层。埋入氧化层用作蚀刻停止，所以，用50％进行蚀刻，以100％以上的周期比预计是必要的，以确保完整的蚀刻。
11. 放置在热致抗蚀剂浴溶液晶片20分钟，剥去光致抗蚀剂。晶圆转移到快速转储冲洗机（QDR）冲洗用去离子水晶圆。以下的光刻胶剥离，加载晶片在SRD中的工具来冲洗和干燥晶片。检查在显微镜下的晶片，以确保如期悬臂模式出现。
12. 沉积1微米厚的一层未掺杂的氧化硅的利用PECVD工具在晶片的器件层上。该氧化层用作保护层的过程中进一步的处理步骤的悬臂。
13. 放置在旋涂机夹头朝上把手层晶片以开始晶片的背面侧的处理。确保晶片的中心，取2毫升P20引物上的晶片的中心，并旋以3000rpm为60秒，在1000转/秒的加速度。
14. 而晶片仍然在旋涂机夹头，分配2毫升SPR220-4.5光致抗蚀剂上的中心晶片，并旋转以2000rpm，持续45秒，以1000转数/秒的加速度以得到6.5微米厚的一层光致抗蚀剂。
15. 放置在接近热板的晶片进行软烘烤，在115℃进行2分钟。
16. 使用光刻接触对准器能够正面/背面对准，对准背侧窗口掩模的前侧悬臂模式和以从背面窗口掩模的图案转移到光致抗蚀剂的操作层上执行硬接触UV曝光。使用基于480毫焦/厘米²为SPR220-4.5光致抗蚀剂的曝光能量值计算的曝光时间。
17. 紫外曝光后，让晶片的下一个处理步骤之前，保持在一个暗区30分钟。
18. 通过浸入晶片开发光致抗蚀剂à726 MIF光刻胶显影剂2分钟，同时轻轻摇晃晶圆来回。
19. 用去离子水（DI）晶片与擦干，最好使用旋转清洗机（SRD）的工具。
20. 放置在烘箱中的晶片在90℃下12小时。
21. 刻蚀使用的RIE系统与氟化气体和配方用于蚀刻氧化物的晶片的背面氧化硅层。在晶片的背面上的图案化的氧化物作为蚀刻掩模，以便进一步处理。检查在显微镜下的晶片，以保证硅氧化物在曝光窗被完全蚀刻。
22. 除去用干净的房间拭子蘸取丙酮在晶片的边缘的光致抗蚀剂（最多5毫米的边缘）。
23. 加载在DRIE工具与晶片并运行一个配方的图案化操作层蚀刻至500μm的深度与埋入氧化层用作蚀刻停止。分割该蚀刻成多个运行，以防止过度加热晶片，这将导致硅的不一致的蚀刻。该蚀刻步骤完全消除悬臂下方的硅。
24. 执行使用25％稀释的HF蚀刻剂，剥离低于悬臂埋入氧化层和上悬臂的顶部的保护性氧化层的湿法蚀刻步骤。
    注意:此步骤发行的硅悬臂梁的底面，也打开了一个窗口下方，以提供一个接入探测与激光的悬臂。
25. 冲洗用一系列的去离子水浴场，仔细用氮气干燥晶圆。由于悬臂是在他们的基地只支持，不直接对悬臂使用去离子水或惰性气体有力的喷雾剂。
26. 从沿着在手柄层的蚀刻步骤中产生的解理线晶片劈开单个芯片。

2，细胞培养

1. 根据此前公布的方法¹⁷准备13F盖玻片。
   注:如果13F海湾rslips不可用，可以使用任何疏水性表面与上述95°的接触角。
2. 消毒悬臂芯片和13F盖玻片的70％乙醇溶液风干的流罩。
3. 广场上的13层顶部盖玻片个人悬臂芯片标准的12孔板内。
4. 涂层与该生物聚合物或表面改性的细胞类型优化的悬臂根据标准细胞培养协议被使用。
5. 在其特定的生长培养基中重悬浮细胞至所需浓度。
   注意:此协议将导致细胞脱落，通过悬臂窗口和未附着到所需悬臂表面有相当多的。细胞制剂因此，应当作出3-4倍比标准盖玻片制剂更加集中。例如，大鼠骨骼肌卫星细胞的播种典型地采用500至700个细胞/平方毫米^15,16的接种密度，并以2,000个细胞/平方毫米使用悬臂衬底。优化实验，应进行新的细胞来源，以确定一个合适的接种密度。
6. 吸取200μl的细胞悬浮液上的悬臂晶片表面，确保介质的泡沫覆盖悬臂窗户完全。如果介质灯芯通过窗口，并不构成对悬臂顶部上的静电气泡取代13F盖玻片并重新尝试电镀。
7. 传送含有芯片的培养箱板和使细胞附着至少1小时（优选2-3小时）。
8. 在此之后的电镀周期，用无菌镊子芯片1毫升生长培养基转移到一个干净的好，没有一个13F盖玻片，加满油的文化。
9. 返回板的孵化器。
10. 根据他们的标准协议，用于在体外维持在盖玻片上维持细胞。对骨骼肌细胞，介质组合物的一个开关来诱导肌管形成一次细胞汇合将是必要的。

3，安装硬件和软件的悬臂挠度分析

1. 将加热的培养皿成一个堂堂正正的电镜的阶段。
2. 添加3毫升目前的细胞悬浮在（+的10mM HEPES）馈送介质的加热显微镜阶段。
3. 安装在加热的培养皿的内侧不锈钢电极以15mm的间隔距离，并将它们连接到脉冲发生器，能够产生不同的强度，频率和波形的场刺激脉冲的，以允许系统以产生场刺激当适当的细胞。
4. 螺栓氦 - 氖激光器，装在XY平移阶段，在显微镜台的下侧，并调整它使得激光束以30°角relativ通过加热培养皿的底部导向E至悬臂的平面。
5. 螺栓象限光检测模块，安装在XY平移阶段，对显微镜载物台的下侧，并调整位置，以使反射的激光束的土地中的4个象限的中心， 图2提供了硬件设置的概况必要为实现所描述的协议。
6. 编写一个软件程序来控制线性致动器的跨悬臂扫描。写，参照图3中提供的流程图，该软件程序。编程为与该系统一起使用的图形界面，在图4中提供。

4，录音悬臂式弯沉数据

1. 打开悬臂分析硬件和相关的软件。
2. 将加热阶段的热敏电阻到培养基中，然后等待它来读取37℃。
3. 插入悬臂芯片与cantileve阶段RS面向舞台的右侧。
4. 打开显微镜光源。
5. 聚焦显微镜使悬臂的边缘进入视野，并使用激光/光电探测器的控制软件来定位激光束对悬臂1。注意的提示:假设悬臂是面向舞台的右边，悬臂1是一个位于阵列的左上角和数字中的左下向下运行至16。悬臂17是在右上位置，并运行到32中的右下角（ 图5A）。
6. 按"PLAY"的录音软件。
7. 定位在光检测器，使得在x和y帧中的信号读出"0"，通过调节步进电机控制的光检测器。
8. 在激光/光检测器的控制软件中设置悬臂1的位置（ 图4）。
9. 移动激光到悬臂16的前端，则重复步骤4.7，并设置cantilevER在激光/光电探测器的控制软件16位。
10. 移动激光到悬臂32的前端，则重复步骤4.7，并设置悬臂32的位置，在激光/光检测器的控制软件。
11. 移动激光到悬臂17的前端，则重复步骤4.7，并设置悬臂17的位置，在激光/光检测器的控制软件。
12. 关掉显微镜光源与架空光在实验室。
13. 在刻录软件，按"记录"。
14. 设置脉冲发生器硬件到40毫秒，5 V脉冲1Hz的频率，并打开机器。
    注意:任选地，采用优化的刺激方案为特定的细胞来源，在这一点上，所述设置是基于使用人类和啮齿动物细胞来源^12,13,15,16收集到的数据的指导方针。
15. 使用激光/光电探测器的控制软件，设置跨越32悬臂阵列扫描硬件，在旺火上停5秒ê。
16. 当32悬臂的扫描完成后，关闭刺激器，然后停止录音软件，实现了数据文件。
17. 检查记录的跟踪每个悬臂的收缩活动的证据。请记下每个悬臂阳性反应。甲收缩被定义为峰，如果偏转是至少0.1 V以上的基线。
18. 从激光/光电探测器的控制软件的扫描协议，删除所有非敏感的悬臂。
19. 活动的悬臂可以再无刺激，以获得细胞的自发收缩活动的阅读来重新扫描。
20. 运行扫描具有或不具有广泛的领域的电刺激之后，另外的治疗性化合物的培养基中，以观察在培养的细胞中的功能性输出的效果。
21. 进行疲劳评估通过电刺激的细胞长时间和对照的水平扫描 actility测量需要多长时间的峰值力下降到低于特定阈值。
22. 在运动神经元中被保持在共培养与肌肉的实验中，测量经过治疗运动神经元，肌管悬臂共培养的神经肌肉接头处形成一个神经兴奋剂（如谷氨酸）或突触抑制剂（ 例如 ，D-筒箭毒碱）和扫描分别为¹⁶自发活动的增加和减少。
23. 作为执行决定的计划实验的需要具体的扫描。

悬臂挠度数据的5分析

1. 使用改性斯通方程^15（下面详述），以生悬臂偏转的数据（以伏特）转换成应力在细胞层或肌管（帕斯卡），并直接测量细胞收缩力（在纳米牛顿）的读出:
   广告/ 51866 / 51866eq1.jpg"/>公式1
   式（2）
2. 其中δ=悬臂尖端偏转和应力的肌管产生_，σC =应力由肌管产生，假设一个均匀的厚薄膜的悬臂，C _检测器的整个宽度=照片与电压到激光位置的系统特定的系数-detector，θ=相对于悬臂的面内的激光和检测器的角度，E _Si为硅的弹性模量， 吨_Si为厚度悬臂的， _吨 f =肌管厚度，V = _硅的毒害的比率硅，L =悬臂长度，激光P =路径长度悬臂针尖至探测器和 w _{Si为悬臂的宽度。的示意性说明在这些方程中使用的术语是在图6中提供。}
3. 假设肌管是均匀的膜，在肌管的力等于在薄膜上的力，从而导致式（3）通过等同的力从应力的计算和假设小区的横截面面积被用于斯通的的应用程序，它方程。
   式（3）
4. 以下功能的数据采集，固定悬臂芯片的免疫细胞化学分析或利用细胞使用标准技术的蛋白质或DNA分析。
5. 可选地，返回，以便在稍后的时间点，重新评估功能表现的细胞培养箱代替制备用于分子分析。

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结果

收缩细胞对悬臂成功的文化是一个相对简单的过程，利用标准的细胞培养技术（ 图5）。悬臂支撑承包细胞的百分比将取决于细胞类型而异正在研究和具体的栽培技术采用。使用从大鼠后肢来源的原胚细胞，收缩活性，对悬臂检查的12％检测到的组（n = 4）。使用所描述的激光和光检测器系统的收缩功能的分析提供了关于所接种的细胞的功能的成熟准确的实时数据。使用标准的电生理?...

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讨论

在分析微尺度悬臂蜂窝收缩证据的关键步骤是在放置于显微镜载物台的悬臂芯片，并且激光和光检测器的阵列中的角悬臂的末端的随后对准。如果不正确地进行，则该软件将无法推断剩余的悬臂的位置的阵列中，从而可能导致假阴性积累数据收集期间。运营商应注意，以确保悬臂芯片校准激光的位置之前，躺在平齐培养皿的底部。如果芯片坐在在盘的角度，它会改变反射激光束的路径和混淆的数?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ml
Ciliary Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ml
Neurotrophin-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ml
Neurotrophin-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ml
Acidic Fibroblast Growth Factor	Life Technologies	13241-013	25 ng/ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ml
Heparin Sulphate	Sigma	D9809	100 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158	20 ng/ml
Vitronectin	Sigma	V0132	100 ng/ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
Equipment
Class 2 red diode laser	Newport
Photo-detector	Noah Industries
Model 2100 Pulse stimulator	A-M systems
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments
Patch clamp microscope and stage	Olympus
Delta T4 culture dish controller	Bioptechs
Axoscope software	Molecular Devices
LabVIEW software	National Instruments
37 oC, 5% CO2 incubator	NAPCO
Class 2 microbiological flow hood	Labconco
Pipettes and tips	Eppendorf