마이크로 실리콘 캔틸레버의 이용은 세포 수축 기능을 평가하기 위해<em&gt; 체외</em

요약

이 프로토콜은 시험 관내에서 근육 세포의 수축력을 측정하기위한 유연한 배양 표면과 같은 실리콘 마이크로 캔틸레버의 사용을 설명한다. 셀룰러 수축 측정 기록하고, 시험 관내에서 수축력을 측정하는 비 침습적이고 확장 가능한 시스템을 제공하고, 힘의 판독 값으로 변환 할 수 외팔보 굽힘을 야기.

초록

더 많은 예측과 관련된 생물학적 시험 관내 분석법의 개발은 시드 세포의 기능 평가를 용이 다목적 세포 배양 시스템의 발전에 입각한다. 이를 위해 마이크로 캔틸레버 벤딩 기술은 기판의 수축에 의한 평가를 통해, 뼈, 심장, 및 평활근 세포를 포함한 세포 유형의 범위의 수축 기능을 측정 할 수있는 플랫폼을 제공한다. 다중화 된 캔틸레버 어레이의 적용은 약물의 효능과 독성 질환 표현형 및 진행뿐만 아니라, 신경 근육 및 기타 세포 - 세포 상호 작용을 평가하기위한 높은 처리량 프로토콜 중등도 개발 수단을 제공한다. 이 논문은이 목적을 위해 신뢰할 수있는 캔틸레버 어레이를 제조하기위한 상세하고, 이들 표면에 성공적으로 세포 배양에 필요한 방법을 제공한다. 또한 설명은 기능적 항문을 수행하는 데 필요한 단계를 제공한다수축성 세포 유형의 ysis는 신규 한 레이저 및 광 검출기 시스템을 사용하여 이러한 배열에서 유지. 하이라이트 정밀도 및이 시스템을 사용하여 가능 수축력의 분석 재현성을 제공하는 자연 대표 데이터뿐만 아니라, 연구의 넓은 범위는 이러한 기술이 적용될 수있다. 이 시스템의 성공은 널리 채택 수단 조사관 티슈 성능 질환 개발 및 신규 한 치료 적 처치에 대한 응답의 더 정확한 예측 선도, 시험관 내에서 신속, 저비용으로 기능 연구를 수행하기 위해 제공 할 수있다.

서문

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades^1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro^3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option^6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models¹¹.

Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells^12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology¹⁴, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection¹⁵. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies^15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.

This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

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프로토콜

1 캔틸레버 칩 제작

설명 제조 단계의 일러스트에 대한 자세한 내용은 그림 1에 나와 있습니다.

1. 오븐에서 실리콘 - 온 - 절연체 (SOI) 웨이퍼를 배치하고이를 탈수 20 분 동안 125 ° C에서 굽는다.
2. 플라즈마를 이용하여 탈수 한 SOI 웨이퍼의 무늬 층 상에 산화 규소 1.5 μm의 두께 층을 증착은 화학 기상 증착 (PECVD)을 첨단 공구.
3. 장치 층이 위를 향하도록 스핀 코터 척에 웨이퍼를 놓습니다. , 웨이퍼 중심 확인 1000 RPM / sec로 가속에 60 초간 3000 rpm에서 웨이퍼의 중심과 스핀에 P20 프라이머 2 ㎖를 분배. P20 프라이머 장치 층에 포토 레지스트의 접착을 촉진시킨다.
4. 웨이퍼 스핀 코터의 척에있는 동안, O 1,000 RPM / sec로 가속에서 60 초 동안 3000 rpm에서 S1818의 웨이퍼의 중심에 포토 레지스트 스핀 2 ㎖를 분배포토 레지스트의 1.5 μm의 두께 층을 btain.
5. 핫 플레이트에 웨이퍼를 놓고 1 분 동안 115 ° C에서 소프트 베이크를 수행합니다.
6. 디바이스 층 상에 포토 레지스트 마스크로부터 캔틸레버 패턴을 전사하기 위해 포토 리소그래피 콘택트 마스크 얼 라이너를 사용하여 하드 콘택트 UV 노광을 수행한다. 125 엠제이 / S1818 포토 레지스트 cm ^(2)의 노광 에너지 값에 기초한 노출 시간을 계산한다.
7. 부드럽게 앞뒤로 흔들어 섞으면 웨이퍼를 1 분간 726 MIF 포토 레지스트 현상액에 웨이퍼를 침지하여 포토 레지스트를 개발한다.
8. 탈 이온화 (DI) 물과 웨이퍼를 씻어 바람직 스핀 세척 건조기 (SRD) 도구를 사용하여, 그것을 건조.
9. 아세톤에 적신 면봉을 사용하여 (가장자리에서 5mm까지) 웨이퍼의 가장자리에서 포토 레지스트를 제거합니다.
10. 포토 레지스트면이 위를 향하도록, 깊은 반응성 이온 에칭 (DRIE) 도구에서 웨이퍼를로드하고, 데비을 통해 패턴 화 된 실리콘 층을 에칭 조리법을 실행CE 층. 에칭 정지로서 매립 산화막 기능하므로 완전한 에칭을 보장 할 필요가있을 것으로 예상되는 것보다 100 % 이상의 사이클 50 %로 에칭을 수행한다.
11. 포토 레지스트를 제거하기 위해 20 분 동안 뜨거운 레지스트 욕 용액에 웨이퍼를 배치했다. DI 워터와 웨이퍼를 씻어 빠른 덤프 - 린서 (QDR)에 웨이퍼를 전송합니다. 포토 레지스트 스트립을 따라 헹구고 웨이퍼를 건조 SRD 도구에서 웨이퍼를로드합니다. 예상대로 캔틸레버 패턴이 나타날 수 있도록 현미경으로 웨이퍼를 검사한다.
12. PECVD 도구를 사용하여 웨이퍼의 장치 층에 언 도핑 실리콘 산화물의 1 μm의 두께 층을 증착. 상기 처리 단계 동안 캔틸레버 보호 층 등이 산화물 층 기능한다.
13. 웨이퍼의 뒷면의 처리를 시작하도록 대향 핸들 층과 스핀 코터의 척에 웨이퍼를 배치했다. 확인 웨이퍼는 3,000 rpm에서 P20의 웨이퍼의 중심에 프라이머, 스핀 2 ㎖를 분배, 중앙1000 RPM / 초 가속에 60 초 동안.
14. 웨이퍼 스핀 코터의 척에있는 동안의 6.5 μm의 두께의 층을 얻기 위해 1,000 RPM / sec로 가속에서 45 초 동안 2000 rpm에서 웨이퍼의 중심과 스핀 상 SPR220-4.5 포토 레지스트 2 ㎖를 분배 포토 레지스트.
15. 2 분 동안 115 ° C에서 소프트 베이크을 수행하기 위해 근접 핫 플레이트에 웨이퍼를 놓습니다.
16. 앞 / 뒷면 정렬 가능한 포토 리소그래피 콘택트 노광 장치를 사용하여, 전방 측 캔틸레버 패턴이면 윈도우 마스크를 정렬 및 처리 층 상에 포토 레지스트를이면 윈도우 마스크로부터 패턴을 전사하기 위해 하드 콘택트 UV 노광을 수행한다. 480 엠제이 / SPR220-4.5 감광액 cm ^(2)의 노광 에너지 값에 기초하여 계산 된 노출 시간을 사용한다.
17. UV 노광 후, 웨이퍼는 다음 처리 단계 이전에 30 분 동안 어두운 영역에 남아하자.
18. 웨이퍼에 침지하여 포토 레지스트를 개발2 분 동안 726 MIF 포토 레지스트 개발 부드럽게 앞뒤로 웨이퍼를 떨고있다.
19. 탈 이온화 (DI) 물과 웨이퍼를 씻어 바람직 스핀 세척 건조기 (SRD) 도구를 사용하여, 그것을 건조.
20. 12 시간 동안 90 ° C의 오븐에서 웨이퍼를 놓습니다.
21. 불소 가스와 RIE 시스템 및 산화물을 에칭하기위한 레시피를 이용하여 상기 웨이퍼의이면에 산화 실리콘 층을 에칭. 웨이퍼의이면에 패터닝 된 산화물은 추가 처리를위한 에칭 마스크로서 작용한다. 노광 창에 실리콘 산화물이 완전히 에칭되도록하여 현미경으로 웨이퍼를 검사한다.
22. 아세톤에 담근 클린 룸 면봉을 사용하여 (가장자리에서 5mm까지) 웨이퍼의 가장자리에 포토 레지스트를 제거합니다.
23. DRIE와 도구의 웨이퍼를 적재 및 에칭 정지 같이 매립 산화물 층 (500)으로 기능하는 μM의 깊이로 패터닝 처리 층을 에칭 레시피를 실행. 의 과열을 방지하기 위해, 복수의 런에이 에칭 분할실리콘의 에칭에 모순이 발생 웨이퍼. 이 에칭 단계는 완전히 캔틸레버 아래의 실리콘을 제거한다.
24. 캔틸레버 아래의 매몰 산화물 층과 상기 캔틸레버의 위에 보호 산화물 층을 제거하기 위해, 25 % 희석 HF 에칭 제를 사용하는 습식 에칭 단계를 수행한다.
    참고 :이 단계는 실리콘 캔틸레버의 바닥면을 해제하고 또한 레이저로 캔틸레버를 조사 할 수있는 액세스를 제공하기 위해 아래 창을 엽니 다.
25. DI 물 화장실의 시리즈와 함께 조심스럽게 건조 질소를 이용하여 웨이퍼를 헹군다. 캔틸레버가 기지만을 지원하기 때문에, 직접 칸틸 레버에 DI 물 또는 불활성 가스의 강제 스프레이를 사용하지 않는다.
26. 핸들 층 에칭 단계 동안 생성 쪼개짐 라인을 따라 웨이퍼로부터 개개의 칩을 쪼갠다.

2 세포 배양

1. 이전에 게시 된 방법 ^17에 따라 13F 된 커버를 준비합니다.
   참고 : 만약 13F 코브rslips는 사용할 수 없으며, 95 ° 이상의 접촉각이 소수성으로 모든 표면이 사용될 수있다.
2. 캔틸레버 칩 및 70 % 에탄올 용액 중의 13F 커버 슬립을 소독하고 흐름 후드에서 공기 건조하도록 허용.
3. 표준 12 웰 플레이트 내부 13F 된 커버의 상단에 각각의 캔틸레버 칩을 놓습니다.
4. 외투 세포 유형에 대해 최적화 생체 고분자 또는 표면 변형에 캔틸레버는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 사용된다.
5. 원하는 농도의 특정 성장 배지에서 세포를 다시 일시.
   참고 :이 프로토콜은 캔틸레버 창을 통해 떨어지는 원하는 캔틸레버 표면에 부착하지 세포의 상당수가 발생합니다. 세포 제제 따라서 커버 슬립 표준 제제에 비해 3-4 배 더 집중해야한다. 예를 들어, 쥐 골격근 위성 세포의 파종은 일반적 500-700 셀 / 평방 mm ^15,16의 시딩 밀도를 이용하여 수행된다및 / 평방 mm 2000 세포에서 캔틸레버 기판에 사용됩니다. 최적화 실험은 적절한 파종 밀도를 확인하기 위해 새로운 셀 소스로 수행되어야한다.
6. 매체의 기포가 완전히 캔틸레버 창 커버 보장 캔틸레버 칩 표면에 세포 현탁액 200 μl를 피펫. 매체가 창을 통해 심지 및 캔틸레버의 상단에 고정 기포를 형성하지 않으면 13F의 커버 슬립을 장착하고 도금을 다시 시도.
7. 인큐베이터에 칩을 함유하는 접시를 전송하고 세포가 적어도 1 시간 (바람직하게는 2 ~ 3 시간)에 대해 부착 할 수있다.
8. 이 도금 기간이 지나면 성장 배지 1 ㎖와 문화를 13F coverslip에없이 깨끗하고 잘에 칩을 전송하고, 상단까지 멸균 집게를 사용합니다.
9. 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
10. 커버 슬립에 체외 유지 보수를 위해 자신의 표준 프로토콜에 따라 세포를 유지한다. 골격근 세포,세포가 합류가 필요합니다이되면 매체 조성물의 스위치는 myotube 형성을 유도한다.

캔틸레버 변형 분석을위한 하드웨어 및 소프트웨어의 3 설치

1. 수직 전기 생리학 현미경의 무대로 가열 된 배양 접시를 놓습니다.
2. 가열 현미경 단계로 세포가 현재 (+ 10 mM의 HEPES)에 현탁 된 공급 매체의 3 ML을 추가합니다.
3. 15mm의 이격 거리에서 가열 된 배양 접시의 안쪽에 스테인리스 전극을 장착하고, 펄스 발생기에 가변 강도, 주파수 및 파형의 필드 자극 펄스를 생성 할 수있는 그들을 연결 시스템들 자극을 생성 할 수 있도록 적절한 때 세포의.
4. , 현미경 테이블의 밑면에, XY 병진 스테이지 상에 장착 헬륨 - 네온 레이저를 볼트와, 레이저 빔이 30 ° 각도로 상대 금지로 가열 된 배양 접시의 바닥을 통해 향하도록하여 조정할캔틸레버의 평면 전자.
5. , 현미경 스테이지의 밑면에, XY 병진 스테이지 상에 장착 사분면 광 검출기 모듈을 볼트와 4 사분면의 중앙 반사 레이저 빔 토지.도 2를하도록 위치를 조정하여 설정할 하드웨어의 개요를 제공한다 설명 된 프로토콜을 구현하는 데 필요한.
6. 캔틸레버에 걸쳐 스캔 선형 액추에이터를 제어하는​​ 소프트웨어 프로그램을 작성합니다. 도 3에서 제공하는 흐름도를 참조하여 소프트웨어 프로그램을 작성한다.이 시스템을 사용하기 위해 프로그램 된 그래픽 인터페이스는도 4에 제공된다.

4 녹음 캔틸레버 편향 데이터

1. 캔틸레버 분석 하드웨어 및 관련 소프트웨어를 켭니다.
2. 중간에 가열 단계 서미스터를 삽입하고 37 ° C를 읽을 때까지 기다립니다.
3. cantileve와 함께 무대에 캔틸레버 칩을 삽입스테이지의 오른손쪽으로 향한 RS.
4. 현미경 광원을 켜십시오.
5. 캔틸레버 가정하면 스테이지의 오른쪽, 캔틸레버 (1)에 배향되어보기로 캔틸레버의 가장자리를 가져오고 캔틸레버 1 NOTE의 팁에 레이저 빔을 위치 시키도록, 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어를 사용하는 현미경 초점 배열의 왼쪽 상단에 위치 하나이며, 숫자는 왼쪽 아래에서 아래로 16까지 실행합니다. 캔틸레버 (17)는 우측 상단 위치에 있고, 오른쪽 아래 (도 5a)에서 (32)에 실행된다.
6. 눌러 레코딩 소프트웨어의 "놀이".
7. 신호가 광 검출기를 제어하는​​ 스텝퍼 모터를 조정함으로써, x 및 y의 범위에 모두 "0"을 읽을 수 있도록 광 검출기를 배치.
8. 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어에서 설정 캔틸레버 한 위치 (그림 4).
9. . 단계 4.7를 반복 캔틸레버 (16)의 끝 부분에 레이저를 이동하고 cantilev 설정ER 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어 (16)에 위치.
10. 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어의 단계 4.7. 및 설정 캔틸레버 (32)의 위치를​​ 반복 캔틸레버 (32)의 끝 부분에 레이저를 이동합니다.
11. 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어의 단계 4.7. 및 설정 캔틸레버 (17)의 위치를​​ 반복 캔틸레버 (17)의 끝 부분에 레이저를 이동합니다.
12. 현미경 광원 및 실험실에서 오버 헤드 빛을 끄십시오.
13. 레코딩 소프트웨어 눌러 "레코드".
14. 1 Hz의 주파수에서 40 밀리 초, 5 V 펄스에 대한 펄스 발생기 하드웨어를 설정하고 기기 전원을 켭니다.
    NOTE : 선택적으로,이 시점에서 특정 셀 소스에 대한 최적의 자극 프로토콜을 사용, 명시된 설정 인간 및 설치류 세포 ^{12,13,15,16 소스를} 사용하여 수집 된 데이터에 기초하여 가이드 라인이다.
15. 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어를 사용하여, 각각에 5 초 동안 정지, 캔틸레버 어레이 (32)를 가로 질러 스캔 할 하드웨어 설정전자.
16. 캔틸레버 (32)의 스캔이 완료되면, 다음 기록 소프트웨어를 중단하고 데이터 파일을 불러 자극기를 끄.
17. 수축 활동의 증거에 대한 각각의 캔틸레버에서 기록 추적을 검사합니다. 긍정적 인 반응과 함께 각 캔틸레버를 기록해 둡니다. 편향 기준선 위에 적어도 0.1 V이면 수축 피크로서 정의된다.
18. 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어에 스캔 프로토콜에서 모든 응답하지 캔틸레버를 제거합니다.
19. 활성 캔틸레버이어서 세포의 자발적인 수축 활성의 판독을 얻기 위해 자극없이 재검사 될 수있다.
20. 배양 된 세포의 기능의 출력에 미치는 영향을 관찰하기 위해 중간에 치료 학적 화합물을 첨가 한 다음, 함께 또는 넓은 전기장 자극없이 검사를 실행.
21. 장기간 전기적 및 CONTR의 주사 레벨 셀을 자극하여 피로 평가를 수행 actility는 특정 임계 값 아래로 떨어 피크 힘 걸리는 시간을 측정합니다.
22. 운동 신경이 근육과 공동 문화 유지된다 실험에서 신경 근육 신경 자극과 운동 신경 - myotube 캔틸레버의 공동 문화의 치료를 통해 접합 형성 (예 : 글루탐산) 또는 시냅스 억제제를 측정 (예를 들어, D-tubocurarine) 및 스캔 자발적인 활동의 증가와 감소는 각각 ^16.
23. 계획된 실험의 요구에 의해 결정으로 특정 검사를 수행합니다.

캔틸레버 편향 데이터의 분석 (5)

1. 사용 스토니 방정식 ¹⁵ 전지 층 또는 myotube (파스칼 단위), 및 (나노 뉴튼) 셀룰러 수축력의 직접 측정에서 응력의 판독에 (볼트) 것의 캔틸레버 편향 데이터를 변환 (아래에 설명) 개질 :
   광고 / 51,866 / 51866eq1.jpg "/> 식 1
   식 (2)
2. δ = 캔틸레버 팁 편향 및 응력 myotube 의해 제조하는 경우, σ _C 균일 후막보기 캔틸레버, C _검출부의 전체 폭을 가정 myotube 의해 생성 = 응력 = 사진에 레이저 위치 전압 관련 시스템 특정 계수 검출기, θ = 캔틸레버의 평면에 레이저 및 검출기 상대적인 각도, E _실리콘은 실리콘의 탄성률 = _t시는 캔틸레버의 두께 = t _F = myotube 두께, _{V의 Si} =의 독 송비 규소, L = 캔틸레버 길이 검출기 캔틸레버 선단으로부터 레이저의 P = 경로 길이, w _{실리콘 캔틸레버의 폭 =. 이들 방정식에서 사용되는 용어를 설명하기 개략은도 6에 제공된다.}
3. 균일 한 필름이 myotube이다 가정 myotube에 힘 스토니의 적용에 사용 된 응력으로부터 힘의 계산 및 추정 셀 단면적을 동일시하여, 3을 수학 식 이어지는 막의 힘 같다 식.
   식 (3)
4. 기능 데이터 수집 후, 면역 세포 화학 분석을 위해 캔틸레버 칩을 수정하거나 표준 기술을 사용하여 단백질 또는 DNA 분석을위한 세포를 사용한다.
5. 선택적으로 나중 포인트에서 기능적 성능을 재평가하기 위해 인큐베이터 대신 분자 분석을위한 준비에 세포를 반환.

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결과

캔틸레버에 수축성 세포의 성공적인 배양은 표준 세포 배양 기술 (도 5)를 이용하여, 비교적 간단한 절차이다. 수축 세포를지지 캔틸레버 백분율 세포 유형에 따라 달라질 것은 검사 및 특정 배양 기술이 채용되고있다. 쥐의 뒷다리에서 파생 된 기본 배아 세포를 사용하여 수축 활동이 조사 캔틸레버의 12 %에서 검출되었다 (N = 4). 설명 된 레이저와 광 검출기 시스템을 사용 수축력 분?...

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토론

셀룰러 수축 증거 마이크로 캔틸레버를 분석하는데 중요한 단계는 현미경 스테이지 내의 캔틸레버 칩의 배치 및 배열 코너 캔틸레버 팁과 레이저와 광 검출기의 후속 정렬이다. 이 정확하게 수행하지 않은 경우, 소프트웨어는 잠재적으로 데이터를 수집하는 동안 위음성의 축적으로 이어지는 배열 잔존 캔틸레버의 위치를​​ 추정 할 수 없습니다. 운영자는 캔틸레버 칩이 레이저의 위치를​​ ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ml
Ciliary Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ml
Neurotrophin-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ml
Neurotrophin-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ml
Acidic Fibroblast Growth Factor	Life Technologies	13241-013	25 ng/ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ml
Heparin Sulphate	Sigma	D9809	100 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158	20 ng/ml
Vitronectin	Sigma	V0132	100 ng/ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
Equipment
Class 2 red diode laser	Newport
Photo-detector	Noah Industries
Model 2100 Pulse stimulator	A-M systems
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments
Patch clamp microscope and stage	Olympus
Delta T4 culture dish controller	Bioptechs
Axoscope software	Molecular Devices
LabVIEW software	National Instruments
37 oC, 5% CO2 incubator	NAPCO
Class 2 microbiological flow hood	Labconco
Pipettes and tips	Eppendorf