لتخصيب Chemoresistant سرطان المبيض الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا البشرية

Summary

وتورط خلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) في ورم الانتكاس بسبب مقاومة كيميائية. لقد الأمثل بروتوكول للاختيار والتوسع في الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض. عن طريق علاج الخلايا مع سيسبلاتين العلاج الكيميائي وزرع الخلايا الجذعية في تعزيز وسائل الإعلام أننا إثراء للثقافات CSC غير ملتصقة.

Abstract

وتعرف الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية)، ومجموعة فرعية من الدراجات بطيئة والخلايا غير المتمايزة التي تقسم غير متماثلة لتوليد التكاثري للغاية، الغازية، والخلايا السرطانية chemoresistant. ولذلك، الخلايا الجذعية السرطانية هي الخلايا السكان جذابة لاستهداف علاجيا. ومن المتوقع الخلايا الجذعية السرطانية إلى المساهمة في عدد من أنواع الأورام الخبيثة بما في ذلك تلك الموجودة في الدم والدماغ والرئة والجهاز الهضمي والبروستاتا والمبيض. عزل وإثراء ويبلغ عدد سكانها الخلايا السرطانية عن الخلايا الجذعية السرطانية تمكين الباحثين من دراسة خصائص وعلم الوراثة، والاستجابة العلاجية الخلايا الجذعية السرطانية. ولدت لدينا البروتوكول الذي يثري بتكاثر الخلايا الجذعية السرطانية لسرطان المبيض المبيض من خطوط الخلايا السرطانية (SKOV3 وOVCA429). يتم التعامل مع خطوط الخلايا مع 20 ميكرومتر سيسبلاتين لمدة 3 أيام. الخلايا على قيد الحياة هي معزولة ومثقف في وسائل الاعلام الخلايا الجذعية خالية من مصل يحتوي على السيتوكينات وعوامل النمو. علينا أن نبرهن على إثراء هذه الخلايا الجذعية السرطانية أكثر نظافة من خلال تحليل خلايا منعزلة لكnown وقف علامات خلية Oct4، NANOG، وProm1 (CD133) والتعبير سطح الخلية من CD177 وCD133. زاد المعرض الخلايا الجذعية السرطانية مقاومة كيميائية. هذه الطريقة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية هي أداة مفيدة لدراسة دور الخلايا الجذعية السرطانية في الورم مقاومة كيميائية والانتكاس.

Introduction

Resistance to chemotherapy is a major impediment to the treatment and cure of cancer. Ovarian cancer is the 5^th leading cause of cancer-related deaths among women in the United States (American Cancer Society Facts and Figures 2013). Patients initially respond well to chemotherapy, but most patients relapse¹. After relapse patients are treated with a variety of additional chemotherapy agents with very little benefit². General properties of CSCs include unlimited proliferative capabilities, retention of an undifferentiated state, resistance to drug treatment, efficient DNA repair, and ability to generate malignant tumor cells with different phenotypes³. CSCs frequently exhibit expression of stem cell genes such as Nanog, Oct4, Sox2, Nestin, CD133, and CD117. CSCs often express elevated levels of ABCG2, and ALDH genes that may contribute to drug efflux and metabolism^3,4.

The first definitive evidence for CSCs was demonstrated by isolating acute myeloid leukemia-initiating cells that were capable of self-renewal and tumor generation⁵. These leukemic stem cells expressed surface CD34 and generated leukemia in NOD/SCID (immunocompromised) mice⁵. Since then CSCs have been identified in many cancer types including leukemias/lymphomas, breast, bladder, colorectal, endometrial, sarcomas, hepatocellular carcinoma, melanomas, gliomas, ovarian, pancreatic, prostate, squamous cell carcinoma, and lung⁶. Therefore, being able to study this subtype of cancer cell is advantageous.

The goal of this study is to create a protocol for the selection and isolation of chemoresistant CSCs. Several methods have been reported for the isolation of CSCs from ovarian cancer cell lines. Non-adherent spheroids isolated from OVCAR-3, SKOV3, or HO8910 cultures demonstrate stem-like properties^7,8. Isolation of CD133+ cells from OVCAR-3 cultures also yields CSCs. CSCs have also been selected in culture by treatment with chemotherapeutic agents. Treating tumor cell lines (OVCA433, Hey, and SKOV3 cells) with cisplatin and paclitaxel allows for the expansion and isolation of CSCs^4,9. While culture of some cell types in CSC media leads to isolation of CSCs, SKOV3 cells did not survive culture in serum-free media or form sphere cells⁴. Therefore, treatment of cells with cisplatin and paclitaxel aided the expansion or isolation of this population⁴.

Using a modification of the procedure presented by Ma and colleagues⁴ we developed a method to isolate CSCs from the ovarian cancer cell lines. Our protocol is advantageous as it yields more viable cells while using less toxic chemotherapeutic agents. Cells are treated with cisplatin and subsequently grown in serum-free media supplemented with growth factors (stem cell media). We isolate the resulting non-adherent sphere cells and assay them for their expression of stem cell markers. This model enables the study of CSC properties and response to drug therapy.

Protocol

1. خلية الثقافة والفلورسنت وصفها من سرطان المبيض خطوط الخلايا

1. إعداد SKOV3 وسائل الإعلام: وسائل الإعلام مكوي تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 0.1 مم L-الجلوتامين، 50 U / البنسلين مل، و 50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. الحفاظ على OVCA429 الخلايا في الحد الأدنى الضروري وسائل الإعلام (MEM) تستكمل مع 10٪ FBS، 1 ملي البيروفات الصوديوم، 0.1 ملي L-الجلوتامين، 50 U / البنسلين مل، و 50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
2. نشر خطوط الخلايا SKOV3 وOVCA429 في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2. تنمو الخلايا على 40-50٪ confluency.
3. توليد الخلايا معربا عن بروتين فلوري الأحمر (RFP) من أجل رصد الجدوى في المختبر وفي الجسم الحي.
   1. على توليد خلايا SKOV3 معربا عن طلب تقديم العروض، إضافة جزيئات lentiviral معربا عن RFP و 10 ميكروغرام / مل polybrene إلى SKOV3 سائل الإعلام في غياب البنسلين والستربتومايسين لمدة 72 ساعة.
   2. بعد 72 ساعة، حدد لطلب تقديم العروض خلايا الإيجابية التي الإسفار خلية المنشط Sortiنانوغرام (FACS) على النحو التالي: يعرض للتريبسين RFP وغير RFP، معربا عن الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 5 دقائق، Resuspend الخلايا في 10 ⁷ خلية / مل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA. على فارز الخلية، واستخدام خلايا غير RFP لتحديد معالم الفرز. ثم جمع الخلايا التي تعبر عن RFP عالية باستخدام الليزر 561 نانومتر.
   3. بدلا من ذلك، إذا البلازميد lentiviral يعبر عن مقاومة المضادات الحيوية كاسيت، حدد لخلايا معربا عن RFP بواسطة زراعة في المضادات الحيوية المناسبة (مثل 10 ملغ / مل blasticidin). ملاحظة: كمية من الجسيمات lentiviral التي تحتاج إلى استخدامها يمكن أن تختلف من دفعة وحسب نوع الخلية. ينبغي تحديد lentiviral السليم عيار لكل نوع من الخلايا.

2. إثراء الخلايا الجذعية للسرطان

1. علاج SKOV3، SKOV3-RFP، أو OVCA429 خطوط الخلايا مع 20 ميكرومتر من سيسبلاتين لمدة 72 ساعة. تنبيه: سيسبلاتين غير السامة. استخدام ملابس واقية / قفازات وتجنب الاتصال مع الجلد والأغشية المخاطية. لا تتخلص من سيسبلاتين طن مياه الصرف الصحي.
2. إعداد CSC وسائل الإعلام: وسائل الإعلام الحرة المصل DMEM / F12 تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة البشري المؤتلف (EGF)، و 10 نانوغرام / مل الأساسي عامل نمو الخلايا الليفية (bFGF)، 12 نانوغرام / مل عامل مثبط اللوكيميا ، و 0.4٪ ألبومين المصل البقري (BSA).
3. خلايا يعرض للتريبسين. ثقافة البقاء على قيد الحياة في خلايا CSC سائل الإعلام.
   ملاحظة: بعد 2 أيام في الثقافة الكروية غير ملتصقة ستشكل.
4. تغيير وسائل الاعلام كل يوم 2 من خلال جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا والطرد المركزي في 125 x ج لمدة 5 دقائق. ثم resuspend الكرية في وسائل الإعلام CSC الطازجة. تحقق الخلايا للبقاء كل أيام 2 عن طريق عد الخلايا وأداء استبعاد أزرق التريبان.
5. ثم جمع الخلايا الجذعية السرطانية لمزيد من التجارب بواسطة الطرد المركزي 129 x ج لمدة 5 دقائق وإعادة التعليق على بيليه في الفينول التي تحتوي على guanidinium thiocynate (RNA)، والفوسفات مخزنة المالحة (PBS: 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، و 11.9 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4) مع 0.1٪ BSA (للالتدفق الخلوي)، أو CSC سائل الإعلام لمواصلةزراعة الخلايا.
6. مراقبة مورفولوجيا الخلايا CSC باستخدام المجهر الضوئي في 20X 40X وتكبير.

3. CSC توصيف عبر تحليل التعبير الجيني للعلامات الخلايا الجذعية

1. جمع 3 الاستعدادات الخلايا الجذعية السرطانية من خلال جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا الطرد المركزي في 129 x ج لمدة 5 دقائق، وإعادة التعليق بيليه في محلول الفينول التي تحتوي على guanidinium thiocynate (أساليب أخرى لاستخراج الحمض النووي الريبي يمكن استخدامها).
2. إعداد الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام TRIzol وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. توليف الحمض النووي التكميلي ([كدنا]) 0،1-1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام المتاحة تجاريا [كدنا عكس نسخ عدة.
3. أداء الكمي كتب الاتجاه المعاكس رد فعل البلمرة المتسلسل (PCR-QRT).
   1. تشكل مزيج الرئيسي لكل مجموعة من الاشعال تحتوي على QRT-PCR مزيج، الاشعال، والماء ليبلغ 8 ميكرولتر لكل عينة (الاشعال مع fluorophores مختلفة يمكن تضخيمه في نفس البئر). على سبيل المثال، وتوليدمزيج الرئيسي واحد لOct4-FAM، NANOG-عرافة، وGAPDH-CY5. يمزج توليد رئيسية منفصلة للNestin وProm1. إضافة 2 ميكرولتر من قالب [كدنا] لكل عينة.
      ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، تم تنفيذ QRT-PCR باستخدام بادئات المدرجة في الجدول 1.
   2. أداء جميع QRT-PCR في نسختين لكل عينة باستخدام PCR الوقت الحقيقي thermocycler قادرة على اكتشاف fluorophores متعددة. تشمل أي ضوابط القالب.
   3. تطبيع الجذعية التعبير الجيني للخلية GAPDH التعبير عن كل عينة باستخدام طريقة ΔΔC _T.

أكتوبر 4-FAM	التمهيدي 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 "
	التمهيدي 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 "
	FAM التحقيق: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 "
NANOG-HEX	التمهيدي 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 "
	التمهيدي 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 "
	HEX التحقيق: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 "
GAPDH-CY5	التمهيدي 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 "
	التمهيدي 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 "
	CY5 التحقيق: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 "
NESTIN-FAM	التمهيدي 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 "
	التمهيدي 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 "
	FAM التحقيق: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 "
CD133-HEX	التمهيدي 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 "
	التمهيدي 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 "
	HEX التحقيق: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3

الجدول 1. الاشعال تستخدم لتوصيف CSC بواسطة QRT-PCR.

e_title "> 4. تحليل الخلايا الجذعية السرطانية لخلية السطح علامات وCD117 CD133

1. الخلايا الجذعية السرطانية الحصاد من خلال جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا والطرد المركزي في 125 x ج لمدة 5 دقائق. إضافة 500 ميكرولتر من حل مفرزة الخلايا غير بروتين لتفكك الخلايا. خلايا الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة حل مفرزة الخلية. ثم يغسل خلايا مرتين مع PBS الباردة.
2. احتضان وسائل الإعلام في النمو الطبيعي لمدة 1 ساعة قبل خلايا وضع العلامات. تدور باستمرار خلايا لمدة 5 دقائق في ز × 129. الخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ BSA مع مكافحة CD133-PE ومكافحة CD117-FITC.
3. إصلاح الخلايا خلال الليل في 1٪ امتصاص العرق. الحذر: غير سامة لامتصاص العرق (يشتبه مسرطنة). جعل في غطاء الدخان واستخدامها في خلال أسبوع.
4. أداء التدفق الخلوي لتحليل CD117 (مع مضاد للCD117 مترافق إلى FITC) وCD133 (مع مكافحة CD133 مترافق إلى PE) التعبير سطح الخلية على تدفق عداد الكريات. جمع بيانات عن الخلايا في FL1 (لFITC) وFL3 (لPE) القنوات. توليد بوابات للخلايا التعبير عن كلFITC و PE. توليد مؤامرة نقطة مع 4 الأرباع (FITC- وPE-، FITC + PE-، FITC- PE +، وFITC و+ + PE) وتحديد عدد الخلايا في كل رباعي.

5. تحليل الخلايا الجذعية السرطانية للاستجابة العلاجية

1. لوحة 5،000 خلايا لكل بئر (SKOV3، SKOV3-RFP، SKOV3 CSC وSKOV3-RFP الخلايا الجذعية السرطانية) على لوحات 96 جيدا بين عشية وضحاها.
2. علاج مع سيسبلاتين (0، 1، 10، 100، و 1،000 ميكرومتر) أو باكليتاكسيل (0، 0.01، 0.1، 1، 10، و 100 ميكرومتر) لمدة 96 ساعة.
3. أداء MTT (3- (4،5-Dimethylthiazol-2-YL) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium) بقاء الخلية الفحص.
   1. لوحة خلايا 5،000 في 100 ميكرولتر لكل بئر على لوحة 96 جيدا (خلايا لوحة من نسختين وتشمل وسائل الإعلام السيطرة على الآبار فقط).
   2. بعد 24 ساعة، إضافة 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل MTT. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة (حتى أشكال متعجلة).
   3. إضافة 100 ميكرولتر من MTT المذيبات 4 ملم حمض الهيدروكلوريك، 0.1٪ NP-40 في الأيزوبروبانول. احتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام.
   4. قراءة لوحات في 570 نانومتر على طبق صeader.

النتائج

لإثبات أننا عزل الخلايا الجذعية السرطانية من المبيض خطوط الخلايا السرطانية الظهارية باستخدام العلاج سيسبلاتين، حصلنا على أول صور للخطوط الخلايا قبل العلاج وبعد الاختيار. استخدمنا المجهر الضوئي لالتقاط الصور من ملتصقة (غير المعالجة) SKOV3 وOVCA429 الخلايا وSKOV3 وOVCA429 الخل?...

Discussion

الخلايا الجذعية السرطانية التي تقاوم العلاج قد يكون مسؤولا عن الانتكاس بعد العلاج من الورم الرئيسي. توصيف الخلايا الجذعية السرطانية قد يؤدي إلى تحسن العلاجات لسرطان المبيض. المعلمات الحرجة في تأسيس الخلايا الجذعية السرطانية chemoresistant باستخدام بروتوكول أعلاه وتوقيت ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy	Life Technologies	16600-108	Warm to 37 °C prior to use
DMEM / F12 serum free	Life Technologies	11320-033	Warm to 37 °C prior to use
Minimal Essential Media	Life Technologies	42360032	Warm to 37 °C prior to use
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360070
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Blasticidin	Life Technologies	R21001
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15070-063
Cisplatin	Sigma-Aldrich	T7402-5MG	Caution: Toxic. Use precautions
pLenti-suCMV-Rsv	Gentarget	LVP023	BSL2 approval needed
Insulin	Sigma-Aldrich	I-1882
Human Recombinant EGF	Cell Signaling Technology	8916LC
bFGF	BD biosciences	354060
LIF	Santa Cruz	sc-4988A
Bovine Serum Albumin	Roche	03 116 956 001
TRIzol	Life Technologies	15596-018
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
IQ Multiplex Powermix	BioRad	1725849
Accumax	Millipore
Primers	Integrated DNA Technology	individually designed and ordered (see protocol for sequnces)
Anti-CD133 PE	Milenyl	130-098-826	Primer/probe sets are light sensitive
CD117-Biotin	Miltenly	130-098-570
AntiBiotin-FITC	Miltenly	130-098-796
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh.
Trypsin	Life Technologies	25300062
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)	Sigma-Aldrich	25200-072
EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope	Advanced Microscopy Group
Biorad CFX96 C1000 System	Biorad
Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer	Beckman Coulter
Spectramax 340PC384	Molecular Devices