ヒト細胞株から化学療法抵抗性の卵巣がん幹細胞の濃縮

要約

癌幹細胞（CSCは）による化学療法耐性に対する腫瘍の再発に関与している。私たちは、選択および卵巣癌細胞株からのCSCの拡張のためのプロトコールを最適化した。化学療法剤シスプラチンで細胞を処理し、私たちは非接着CSC培養液を濃縮するメディアを促進幹細胞で培養することによる。

要約

癌幹細胞（CSCが）をゆっくりサイクリング、高度に増殖性の侵襲性生成するために非対称的に分裂未分化細胞、および化学療法抵抗性の腫瘍細胞のサブセットとして定義される。そのため、CSCは、治療標的とする細胞の魅力的な集団である。 CSCは、血液、脳、肺、胃腸管、前立腺、および卵巣のものを含む悪性腫瘍の種類の数に貢献すると予想される。単離とのCSCのための腫瘍細胞集団を濃縮すると、プロパティ、遺伝学、およびのCSC治療反応を研究する研究者ができるようになります。私たちは、再現可能に卵巣癌細胞株（SKOV3及びOVCA429）から卵巣癌のCSCが富化プロトコルを生成しました。細胞株は、3日間20μMのシスプラチンで処理される。生存細胞は、サイトカインおよび成長因子を含む血清を含まない幹細胞培地中で単離され、培養される。私たちは、kの単離した細胞を分析することによって、これらの精製のCSCの濃縮を実証ノウン細胞マーカーのOct4、Nanogの、およびPROM1（CD133）およびCD177およびCD133の細胞表面発現ステム。 CSCは展示は化学療法抵抗性を増加させた。 CSCを単離するためのこの方法は、化学療法抵抗性および腫瘍の再発でのCSCの役割を研究するための有用なツールである。

概要

Resistance to chemotherapy is a major impediment to the treatment and cure of cancer. Ovarian cancer is the 5^th leading cause of cancer-related deaths among women in the United States (American Cancer Society Facts and Figures 2013). Patients initially respond well to chemotherapy, but most patients relapse¹. After relapse patients are treated with a variety of additional chemotherapy agents with very little benefit². General properties of CSCs include unlimited proliferative capabilities, retention of an undifferentiated state, resistance to drug treatment, efficient DNA repair, and ability to generate malignant tumor cells with different phenotypes³. CSCs frequently exhibit expression of stem cell genes such as Nanog, Oct4, Sox2, Nestin, CD133, and CD117. CSCs often express elevated levels of ABCG2, and ALDH genes that may contribute to drug efflux and metabolism^3,4.

The first definitive evidence for CSCs was demonstrated by isolating acute myeloid leukemia-initiating cells that were capable of self-renewal and tumor generation⁵. These leukemic stem cells expressed surface CD34 and generated leukemia in NOD/SCID (immunocompromised) mice⁵. Since then CSCs have been identified in many cancer types including leukemias/lymphomas, breast, bladder, colorectal, endometrial, sarcomas, hepatocellular carcinoma, melanomas, gliomas, ovarian, pancreatic, prostate, squamous cell carcinoma, and lung⁶. Therefore, being able to study this subtype of cancer cell is advantageous.

The goal of this study is to create a protocol for the selection and isolation of chemoresistant CSCs. Several methods have been reported for the isolation of CSCs from ovarian cancer cell lines. Non-adherent spheroids isolated from OVCAR-3, SKOV3, or HO8910 cultures demonstrate stem-like properties^7,8. Isolation of CD133+ cells from OVCAR-3 cultures also yields CSCs. CSCs have also been selected in culture by treatment with chemotherapeutic agents. Treating tumor cell lines (OVCA433, Hey, and SKOV3 cells) with cisplatin and paclitaxel allows for the expansion and isolation of CSCs^4,9. While culture of some cell types in CSC media leads to isolation of CSCs, SKOV3 cells did not survive culture in serum-free media or form sphere cells⁴. Therefore, treatment of cells with cisplatin and paclitaxel aided the expansion or isolation of this population⁴.

Using a modification of the procedure presented by Ma and colleagues⁴ we developed a method to isolate CSCs from the ovarian cancer cell lines. Our protocol is advantageous as it yields more viable cells while using less toxic chemotherapeutic agents. Cells are treated with cisplatin and subsequently grown in serum-free media supplemented with growth factors (stem cell media). We isolate the resulting non-adherent sphere cells and assay them for their expression of stem cell markers. This model enables the study of CSC properties and response to drug therapy.

プロトコル

卵巣癌細胞株の1。細胞培養および蛍光標識

1. 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したマッコイ培地、0.1 mMのL-グルタミン、50 U / mlペニシリン、および50μg/ mlストレプトマイシン：SKOV3メディアを準備する。 10％FBS、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1 mMのL-グルタミン、50 U / mlペニシリン、および50μg/ mlのストレプトマイシンを補充した最小必須培地（MEM）でOVCA429細胞を維持する。
2. 5％のCO _2、37℃で加湿インキュベーター中SKOV3とOVCA429細胞株を伝播します。 40〜50％の集密度に細胞を成長させる。
3. インビトロおよびインビボでの生存率を監視するために、赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現する細胞を生成する。
   1. RFPを発現してSKOV3細胞を生成するには、72時間ペニシリンおよびストレプトマイシンが存在しない場合に、RFPとSKOV3メディアへの10μg/ mlのポリブレンを発現するレンチウイルス粒子を添加する。
   2. 72時間後、蛍光活性化細胞SortiによってRFP陽性の細胞を選択するngの（FACS）を以下のようにトリプシン処理のRFPおよび非RFP発現細胞を、5分間、125×gで遠心分離、0.1％BSAを含有するPBS中で10 ⁷細胞/ mlで再懸濁細胞。セルソーターに、選別パラメータを決定する非RFP細胞を使用する。その後、561 nmのレーザーを用いて高RFPを発現する細胞を集める。
   3. レンチウイルスプラスミドは、抗生物質耐性カセットを表現する場合には別の方法として、適切な抗生物質中で培養することによってRFP発現する細胞を選択します（例えば10 mg / mlのブラストサイ）。注：使用する必要があるレンチウイルス粒子の量は、バッチによっておよび細胞型によって変化することができる。適切なレンチウイルス力価は、各細胞型について決定されるべきである。

がん幹細胞の2。エンリッチメント

1. 72時間のシスプラチン、20μMとSKOV3、SKOV3-RFP、またはOVCA429細胞株を扱う。注意：シスプラチンは毒性が強い。防護服/手袋を使用し、皮膚や粘膜の膜との接触を避ける。シスプラチン私に捨てないでくださいn個の排水。
2. CSCメディアの準備：5μg/ mlのインスリン、10ng / mlのヒト組換え上皮成長因子（EGF）、10ng / mlの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を補充した無血清DMEM / F12培地を、12 / mlの白血病抑制因子および0.4％ウシ血清アルブミン（BSA）。
3. 細胞をトリプシン処理。 CSC培地中で生存細胞培養。
   注：文化非接着スフェロイド中2日後に形成することになる。
4. 細胞を含有し、5分間125×gで遠心分離し、メディアを収集することにより、2日おきにメディアを変更します。そして、新鮮なCSC培地でペレットを再懸濁します。細胞を計数し、トリパンブルー排除を実行することにより、2日ごとに実行可能性のために細胞を確認してください。
5. その後、5分間129×gでの遠心分離グアニジニウムthiocynate（RNA）を含むフェノールペレットを再懸濁することにより更なる実験のためのCSCを収集、リン酸緩衝生理食塩水（PBS：137mMのNaCl、2.7mMのKCl、11.9 mMリン酸緩衝液、pH7.4）で（フローサイトメトリー用の）0.1％のBSA、またはCSCメディアが継続する細胞を培養する。
6. 20Xと40Xの倍率で光学顕微鏡を用いてCSC細胞形態を監視します。

幹細胞マーカーのための遺伝子発現解析を経由して3のCSCキャラ

1. メディアは5分間129×gで遠心分離し、細胞を含有する収集、およびフェノールを含むグアニジニウムthiocynateの溶液中にペレットを再懸濁することにより、CSCの3製剤を集める（RNA抽出のための他の方法を用いることができる）。
2. 製造業者のプロトコールに従ってTRIzolを使用して全RNAを準備します。市販のcDNA逆転写キットを用いてRNAの0.1μgのから相補的DNA（cDNA）を合成する。
3. 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）を行う。
   1. サンプルあたり8μlの総するQRT-PCRミックス、プライマー、および水を含むプライマーのセットごとにマスターミックスを構成する（異なる蛍光体を有するプライマーは、同じウェルで増幅することができる）。例えば、生成する1のOct4-FAM用のマスターミックス、Nanogの、ヘックス、およびGAPDH-CY5。ネスチンとPROM1に個別のマスターミックスを生成します。サンプルあたりのcDNA鋳型の2を添加する。
      注記：この研究のために、QRT-PCRは、表1に列挙されたプライマーを用いて行った。
   2. 複数のフルオロフォアを検出することが可能なリアルタイムPCRサーモを使用して、各サンプルについてはすべて2重QRT-PCRを実行します。何テンプレートコントロールが含まれていない。
   3. _ΔΔCT法を用いて、各サンプルについてGAPDHの発現に対する幹細胞の遺伝子発現を正規化する。

10月 - 4-FAM	プライマー1：5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 '
	プライマー2：5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 '
	FAMプローブ：5'-CTTCCAAGC / ZEN / TG​​CCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 '
のNanog-HEX	プライマー1：5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 '
	プライマー2：5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 '
	HEXプローブ：5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 '
GAPDH-CY5	プライマー1：5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 '
	プライマー2：5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 '
	CY5プローブ：5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 '
ネスチン-FAM	プライマー1：5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 '
	プライマー2：5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 '
	FAMプローブ：5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 '
CD133-HEX	プライマー1：5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 '
	プライマー2：5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 '
	HEXプローブ：5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3

QRT-PCRにより、CSCの特徴付けに使用表1プライマー。

e_title "> 4。細胞表面マーカーCD117及びCD133のためのCSCの分析

1. 細胞を含有し、5分間125×gで遠心分離媒体を収集することによって収穫のCSC。細胞を、破壊するために、非タンパク質分解細胞剥離溶液500μlを追加します。 5分間125×gで遠心分離細胞は、細胞剥離液を除去した。その後、冷たいPBSで2回細胞を洗浄する。
2. 標識細胞の前に1時間、通常の増殖培地中でインキュベートする。 129×gで5分間細胞をスピンダウン。抗CD133-PEおよび抗CD117-FITC 0.1％BSAを含むPBSで細胞を再懸濁する。
3. 1％パラホルムアルデヒド中で一晩細胞を固定します。注意：ホルムアルデヒドは有毒（被疑物質）である。ドラフト内で行って、一週間以内に使用しています。
4. CD117（FITCと結合した抗CD117付き）と（PEに結合した抗CD133付き）CD133フローサイトメーター上の細胞表面発現を分析するために、フローサイトメトリーを実行します。チャネル（PE用）（FITC用）FL1とFL3のセルのデータを収集します。の両方を発現する細胞についてゲートを生成するFITCおよびPE。 4象限（FITC-とPE-、FITC + PE-、FITC- PE +、およびFITC +およびPE +）とのドットプロットを生成し、各象限における細胞の数を決定します。

5。治療反応のためのCSCの分析

1. プレートを一晩96ウェルプレート上にウェル当たり5,000細胞（SKOV3、SKOV3-RFP、SKOV3 CSCとSKOV3-RFPのCSC）。
2. 96時間シスプラチン（0、1、10、100、1000μM）またはパクリタキセル（0、0.01、0.1、1、10、及び100μM）で処理する。
3. MTT（3 - （4,5 - ジメチルチアゾール2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラブロミド）細胞生存率アッセイを行う。
   1. プレート5000 96ウェルプレート上のウェルあたり100μlあたりの細胞（連でプレート細胞および培地のみ対照ウェルが含まれる）。
   2. 24時間後、10 mg / mlのMTTを10μlを加える。 （沈殿物が形成されるまで）2-4時間、37℃でインキュベートする。
   3. MTT溶剤4 mMのHClを100μlの、イソプロパノール中の0.1％NP-40を追加します。暗所で15分間インキュベートします。
   4. プレートrに570nmでプレートを読むeader。

結果

私たちは、シスプラチン処理を用いて上皮性卵巣癌細胞株からのCSCを単離することを実証するために、最初の治療の前および選択後の細胞系の画像を取得した。私たちは、付着性（未処理）SKOV3とOVCA429細胞およびSKOV3とOVCA429のCSC（ 図1）の画像をキャプチャするために、光学顕微鏡を使用していました。 CSCはラウンド表示され、組織培養プレート（ 図1および?...

ディスカッション

治療に抵抗性であるCSCは、原発腫瘍の治療後の再発に責任があります。 CSCはの特徴付けは、卵巣癌のための改善された治療法につながる可能性があります。上記のプロトコルを使用して、化学療法抵抗性のCSCの確立において重要なパラメータは、化学療法による治療の長さおよび化学療法の濃度チャートである。 Ma らにプロトコルを使用する場合。それは、シスプラチン及びパクリ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy	Life Technologies	16600-108	Warm to 37 °C prior to use
DMEM / F12 serum free	Life Technologies	11320-033	Warm to 37 °C prior to use
Minimal Essential Media	Life Technologies	42360032	Warm to 37 °C prior to use
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360070
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Blasticidin	Life Technologies	R21001
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15070-063
Cisplatin	Sigma-Aldrich	T7402-5MG	Caution: Toxic. Use precautions
pLenti-suCMV-Rsv	Gentarget	LVP023	BSL2 approval needed
Insulin	Sigma-Aldrich	I-1882
Human Recombinant EGF	Cell Signaling Technology	8916LC
bFGF	BD biosciences	354060
LIF	Santa Cruz	sc-4988A
Bovine Serum Albumin	Roche	03 116 956 001
TRIzol	Life Technologies	15596-018
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
IQ Multiplex Powermix	BioRad	1725849
Accumax	Millipore
Primers	Integrated DNA Technology	individually designed and ordered (see protocol for sequnces)
Anti-CD133 PE	Milenyl	130-098-826	Primer/probe sets are light sensitive
CD117-Biotin	Miltenly	130-098-570
AntiBiotin-FITC	Miltenly	130-098-796
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh.
Trypsin	Life Technologies	25300062
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)	Sigma-Aldrich	25200-072
EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope	Advanced Microscopy Group
Biorad CFX96 C1000 System	Biorad
Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer	Beckman Coulter
Spectramax 340PC384	Molecular Devices