העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Summary

תאי גזע סרטני (CSCS) הם מעורבים בהישנות גידול עקב chemoresistance. יש לנו אופטימיזציה פרוטוקול לבחירה והרחבת CSCS משורות תאי סרטן השחלות. על ידי טיפול בתאים עם ציספלטין כימותרפיות וculturing בתאי גזע קידום תקשורת אנו מעשירים לתרבויות CSC לא חסידות.

Abstract

תאי גזע סרטני (CSCS) מוגדרים כקבוצת משנה של רכיבה על אופניים איטיים ותאים שלא עברו התמיינות אשר מחלקים סימטרי ליצירת שגשוג מאוד, חודרני, ותאי גידול chemoresistant. לכן, CSCS הוא אוכלוסייה אטרקטיבית של תאים למקד טיפולי. CSCS הם חזו לתרום למספר סוגי סרטן כמו כולל אלו שבדם, המוח, ריאות, מערכת עיכול, ערמונית, והשחלה. בידוד והעשרת אוכלוסיית תאים סרטניים לCSCS תאפשר לחוקרים ללמוד את המאפיינים, גנטיקה, ותגובה הטיפולית של CSCS. אנחנו שנוצרנו פרוטוקול שמעשיר reproducibly לCSCS סרטן השחלות משורות תאי סרטן השחלות (SKOV3 וOVCA429). מטופלים שורות תאים עם 20 ציספלטין מיקרומטר במשך 3 ימים. תאים ששרדו מבודדים ותרבותיים בתקשורת של תאי גזע ללא סרום המכילה ציטוקינים וגורמי גדילה. אנו מדגימים העשרת CSCS המטוהר אלה על ידי ניתוח התאים המבודדים לknown תאי גזע סמני Oct4, Nanog, וProm1 (CD133) וביטוי בתא שטח של CD177 וCD133. תערוכת CSCS מוגברת chemoresistance. שיטה זו לבידודה של CSCS היא כלי שימושי לחקר תפקידה של CSCS בהישנות chemoresistance וגידול.

Introduction

Resistance to chemotherapy is a major impediment to the treatment and cure of cancer. Ovarian cancer is the 5^th leading cause of cancer-related deaths among women in the United States (American Cancer Society Facts and Figures 2013). Patients initially respond well to chemotherapy, but most patients relapse¹. After relapse patients are treated with a variety of additional chemotherapy agents with very little benefit². General properties of CSCs include unlimited proliferative capabilities, retention of an undifferentiated state, resistance to drug treatment, efficient DNA repair, and ability to generate malignant tumor cells with different phenotypes³. CSCs frequently exhibit expression of stem cell genes such as Nanog, Oct4, Sox2, Nestin, CD133, and CD117. CSCs often express elevated levels of ABCG2, and ALDH genes that may contribute to drug efflux and metabolism^3,4.

The first definitive evidence for CSCs was demonstrated by isolating acute myeloid leukemia-initiating cells that were capable of self-renewal and tumor generation⁵. These leukemic stem cells expressed surface CD34 and generated leukemia in NOD/SCID (immunocompromised) mice⁵. Since then CSCs have been identified in many cancer types including leukemias/lymphomas, breast, bladder, colorectal, endometrial, sarcomas, hepatocellular carcinoma, melanomas, gliomas, ovarian, pancreatic, prostate, squamous cell carcinoma, and lung⁶. Therefore, being able to study this subtype of cancer cell is advantageous.

The goal of this study is to create a protocol for the selection and isolation of chemoresistant CSCs. Several methods have been reported for the isolation of CSCs from ovarian cancer cell lines. Non-adherent spheroids isolated from OVCAR-3, SKOV3, or HO8910 cultures demonstrate stem-like properties^7,8. Isolation of CD133+ cells from OVCAR-3 cultures also yields CSCs. CSCs have also been selected in culture by treatment with chemotherapeutic agents. Treating tumor cell lines (OVCA433, Hey, and SKOV3 cells) with cisplatin and paclitaxel allows for the expansion and isolation of CSCs^4,9. While culture of some cell types in CSC media leads to isolation of CSCs, SKOV3 cells did not survive culture in serum-free media or form sphere cells⁴. Therefore, treatment of cells with cisplatin and paclitaxel aided the expansion or isolation of this population⁴.

Using a modification of the procedure presented by Ma and colleagues⁴ we developed a method to isolate CSCs from the ovarian cancer cell lines. Our protocol is advantageous as it yields more viable cells while using less toxic chemotherapeutic agents. Cells are treated with cisplatin and subsequently grown in serum-free media supplemented with growth factors (stem cell media). We isolate the resulting non-adherent sphere cells and assay them for their expression of stem cell markers. This model enables the study of CSC properties and response to drug therapy.

Protocol

.1 תא תרבות ותיוג פלורסנט של שורות תאי סרטן השחלות

1. הכן תקשורת SKOV3: תקשורת מקוי בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), L-גלוטמין 0.1 מ"מ, 50 U / ml פניצילין, ו50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. לשמור OVCA429 תאים בתקשורת המינימלי חיונית (MEM) בתוספת 10% FBS, פירובט נתרן 1 מ"מ, L-גלוטמין 0.1 מ"מ, 50 U / ml פניצילין, ו50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
2. הפץ שורות תאי SKOV3 וOVCA429 בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2. לגדל תאים לconfluency 40-50%.
3. לייצר תאים לבטא חלבון אדום ניאון (RFP) במטרה לעקוב אחר כדאיות במבחנת in vivo.
   1. כדי ליצור תאי SKOV3 להביע RFP, להוסיף חלקיקי lentiviral להביע RFP וpolybrene / מ"ל ​​10 מיקרוגרם לתקשורת SKOV3 בהעדר פניצילין וסטרפטומיצין ל72 שעה.
   2. לאחר 72 שעה, לבחור עבור RFP תאים חיוביים על ידי תא הקרינה הופעל Sorting (FACS) כדלקמן: RFP Trypsinize ולא RFP לבטא בתאים, צנטריפוגות ב XG 125 למשך 5 דקות, תאים גלולים ב10 ⁷ / מ"ל תאי PBS המכיל BSA 0.1%. על סדרן תא, להשתמש בתאים שאינם RFP כדי לקבוע את הפרמטרים למיון. ואז לאסוף תאי המבטאים גבוה RFP באמצעות לייזר 561 ננומטר.
   3. לחלופין, אם פלסמיד lentiviral מבטא קלטת עמידות לאנטיביוטיקה, לבחור עבור תאי RFP להביע ידי culturing באנטיביוטיקה המתאימה (כגון 10 מ"ג / מ"ל ​​blasticidin). הערה: הכמות של חלקיקי lentiviral שצריך להיות בשימוש יכול להשתנות על ידי אצווה ועל ידי סוג תא. כייל lentiviral נכון צריך להיות שנקבע לכל סוג תא.

.2 העשרה של תאי גזע סרטניים

1. פנק את SKOV3, SKOV3-RFP, או OVCA429 שורות תאים עם 20 מיקרומטר של ציספלטין ל72 שעה. זהירות: ציספלטין הוא רעיל. השתמש בבגדים / כפפות מגן ולהימנע ממגע עם קרומי עור וריר. אל תשליך אני ציספלטיןשפכי n.
2. הכן תקשורת CSC: תקשורת DMEM / F12 סרום ללא תוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין, 10 ng / גורם גדילה באפידרמיס רקומביננטי אנושי מ"ל (EGF), 10 ng / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי מ"ל (bFGF), ng 12 / גורם מעכב לוקמיה מ"ל , ואלבומין 0.4% בסרום שור (BSA).
3. תאי Trypsinize. תרבות ששרד תאים בתקשורת CSC.
   הערה: לאחר 2 ימים בspheroids שאינו חסיד התרבות יהוו.
4. שינוי בתקשורת כל 2 ימים על ידי איסוף מדיה המכילה תאים וצנטריפוגה ב125 XG למשך 5 דקות. אז resuspend גלולה בתקשורת CSC הטרי. בדקו תאים לכדאיות כל 2 ימים על ידי ספירת תאים וביצוע הרחקת trypan כחולה.
5. ואז לאסוף CSCS עבור ניסויים נוספים על ידי צנטריפוגה 129 XG למשך 5 דקות וresuspending גלולה בthiocynate פנול המכיל guanidinium (RNA), שנאגרו מלוח פוספט (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, ו11.9 מ"מ חיץ פוספט, pH 7.4) עם BSA 0.1% (עבור cytometry זרימה), או מדיה CSC להמשיךculturing התאים.
6. צג מורפולוגיה של תאי CSC באמצעות מיקרוסקופ אור ב20X ו40X הגדלה.

.3 אפיון CSC באמצעות ניתוח ביטוי גנים לסמני תאי גזע

1. לאסוף 3 הכנות של CSCS על ידי איסוף מדיה המכילה תאים, צנטריפוגה ב129 XG למשך 5 דקות, וresuspending גלולה בפתרון של thiocynate guanidinium פנול המכיל (ניתן להשתמש בשיטות אחרות להפקת RNA).
2. הכן RNA סך באמצעות TRIzol על פי הפרוטוקול של היצרן. לסנתז DNA המשלים (cDNA) .1-1 מיקרוגרם של RNA באמצעות ערכת cDNA ההפוך תמלול זמינה מסחרי.
3. לבצע תגובה הפוכה עיבד כמותית השרשרת של פולימראז (qRT-PCR).
   1. מרכיבים את תערובת הורים עבור כל קבוצה של פריימרים המכילים תערובת qRT-PCR, פריימרים, ומים לסך 8 μl לדגימה (יכולים להיות מוגברים פריימרים עם fluorophores שונה באותה היטב). לדוגמא, ליצורתערובת אב אחד לOct4-FAM, Nanog-Hex, וGAPDH-Cy5. צור תערובות הורים נפרדות לNestin וProm1. הוסף 2 μl של תבנית cDNA לדגימה.
      הערה: במחקר זה, qRT-PCR בוצע באמצעות פריימרים מפורטים בטבלה 1.
   2. לבצע את כל qRT-PCR בשני עותקים עבור כל דגימה באמצעות זמן אמת thermocycler PCR מסוגל לאתר fluorophores מרובה. כולל לא שולט תבנית.
   3. לנרמל ביטוי גנים בתאי גזע לביטוי GAPDH עבור כל דגימה בשיטת ΔΔC _T.

אוקטובר -4-FAM	פריימר 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 "
	פריימר 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 "
	בדיקה FAM: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 "
Nanog-HEX	פריימר 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 "
	פריימר 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 "
	הבדיקה HEX: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 "
GAPDH-Cy5	פריימר 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 "
	פריימר 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 "
	הבדיקה Cy5: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 "
Nestin-FAM	פריימר 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 "
	פריימר 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 "
	בדיקה FAM: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 "
CD133-HEX	פריימר 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 "
	פריימר 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 "
	הבדיקה HEX: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3

Primers הטבלה 1 המשמש לאפיון CSC ידי qRT-PCR.

e_title "> 4. CSCS ניתוח לתא שטח סמני CD117 וCD133

1. CSCS קציר על ידי איסוף מדיה המכילה תאים וצנטריפוגה ב125 XG למשך 5 דקות. הוסף 500 μl של פתרון ניתוק מסוג התאים לא פרוטאוליטים לשבור-up תאים. תאי צנטריפוגה ב125 XG למשך 5 דקות כדי להסיר פתרון ניתוק תא. לאחר מכן לשטוף את תאים פעמיים עם PBS הקר.
2. דגירה בתקשורת צמיחה נורמלית עבור שעה 1 לפני תאי תיוג. ספין למטה תאים 5 דקות ב129 x גרם. Resuspend תאים בPBS עם BSA 0.1% עם אנטי CD133-PE ואנטי CD117-FITC.
3. תקן תאי הלילה בparaformaldehyde 1%. זהירות: Paraformaldehyde הוא (קרצינוגן חשד) רעיל. הפוך במנדף ולהשתמש תוך שבוע.
4. לבצע cytometry זרימה לנתח CD117 (עם אנטי CD117 מצומדת לFITC) ביטוי על פני השטח של תאים בזרימה cytometer וCD133 (עם אנטי CD133 מצומדת לPE). לאסוף נתונים על תאים בFL1 (לFITC) וFL3 (לPE) ערוצים. צור שערים לתאים המבטאים את שניFITC וPE. צור עלילת נקודה עם 4 רביעים (FITC- וPE-, FITC + PE-, FITC- PE +, וFITC + וPE +) ולקבוע את מספר התאים בכל רבע.

.5 ניתוח CSCS לתגובה טיפולית

1. צלחת 5,000 תאים לכל טוב (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3 CSC וSKOV3-RFP CSCS) על צלחות 96 היטב הלילה.
2. פנקו עם ציספלטין (0, 1, 10, 100, ו1,000 מיקרומטר) או פקליטקסל (0, 0.01, 0.1, 1, 10, ו100 מיקרומטר) ל96 שעה.
3. בצע MTT (3 (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay כדאיות תא.
   1. צלחת תאים 5,000 לכל טוב 100 μl על צלחת 96 היטב (תאי צלחת בשני עותקים וכוללים תקשורת לשלוט רק בארות).
   2. לאחר 24 שעות, להוסיף 10 μl של 10 מ"ג / מ"ל ​​MTT. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2-4 שעות (עד צורות משקע).
   3. הוספה של MTT ממס 4 מ"מ HCl 100 μl, 0.1% NP-40 בisopropanol. דגירה במשך 15 דקות בחושך.
   4. קראו צלחות ב570 ננומטר על r צלחתeader.

תוצאות

על מנת להוכיח כי אנו מבודדים CSCS משורות תאי סרטן השחלות אפיתל באמצעות טיפול ציספלטין, שרכשנו ראשון את תמונות של שורות התאים לפני טיפול ואחרי הבחירה. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ אור כדי ללכוד תמונות של חסיד (ללא טיפול) SKOV3 וOVCA429 תאים וSKOV3 וOVCA429 CSCS (איור 1). CSCS להופיע ?...

Discussion

CSCS כי הם עמידים לטיפול עשוי להיות אחראי להישנות לאחר הטיפול של גידול ראשוני. אפיון של CSCS עלול להוביל לטיפולים משופרים לסרטן השחלות. הפרמטרים הקריטיים בהקמת CSCS chemoresistant באמצעות הפרוטוקול לעיל תזמון משך טיפול עם כימותרפיה והריכוז של כימותרפיה. בעת שימוש בפרוטוקול בא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy	Life Technologies	16600-108	Warm to 37 °C prior to use
DMEM / F12 serum free	Life Technologies	11320-033	Warm to 37 °C prior to use
Minimal Essential Media	Life Technologies	42360032	Warm to 37 °C prior to use
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360070
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Blasticidin	Life Technologies	R21001
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15070-063
Cisplatin	Sigma-Aldrich	T7402-5MG	Caution: Toxic. Use precautions
pLenti-suCMV-Rsv	Gentarget	LVP023	BSL2 approval needed
Insulin	Sigma-Aldrich	I-1882
Human Recombinant EGF	Cell Signaling Technology	8916LC
bFGF	BD biosciences	354060
LIF	Santa Cruz	sc-4988A
Bovine Serum Albumin	Roche	03 116 956 001
TRIzol	Life Technologies	15596-018
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
IQ Multiplex Powermix	BioRad	1725849
Accumax	Millipore
Primers	Integrated DNA Technology	individually designed and ordered (see protocol for sequnces)
Anti-CD133 PE	Milenyl	130-098-826	Primer/probe sets are light sensitive
CD117-Biotin	Miltenly	130-098-570
AntiBiotin-FITC	Miltenly	130-098-796
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh.
Trypsin	Life Technologies	25300062
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)	Sigma-Aldrich	25200-072
EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope	Advanced Microscopy Group
Biorad CFX96 C1000 System	Biorad
Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer	Beckman Coulter
Spectramax 340PC384	Molecular Devices