Обогащение химиорезистентных рака яичников стволовых клеток из человеческих клеточных линиях

Резюме

Раковые стволовые клетки (ЦОК) вовлечены в рецидива опухоли за счет химической устойчивости. Мы оптимизировали протокол для отбора и расширения ЦОНов от рака яичников клеточных линий. По обработке клеток химиотерапевтического цисплатин и культивирование в стволовой клетки содействия СМИ мы обогащаем для неадгезивных культур CSC.

Аннотация

Раковые стволовые клетки (ЦОК) определяются как подмножество медленной езды на велосипеде и недифференцированных клеток, которые делятся асимметрично генерировать высоко пролиферативные, инвазивные и химиорезистентных опухолевых клеток. Поэтому, CSCs являются привлекательным популяция клеток целевой терапевтически. ОКК по прогнозам, способствовать ряда видов злокачественных опухолей в том числе в крови, мозге, легких, желудочно-кишечного тракта, предстательной железы, яичника и. Изоляция и обогащения популяции опухолевых клеток для ЦОНов позволит исследователям изучать свойства, генетика, и терапевтический ответ ЦОНов. Мы создали протокол, который воспроизводимо обогащает для яичников ЦОНов рака яичников линий раковых клеток (SKOV3 и OVCA429). Клеточные линии, которые обрабатывают 20 мкМ цисплатина в течение 3 дней. Выжившие клетки выделяют и культивируют в не содержащей сыворотки среде стволовых клеток, содержащей цитокины и факторы роста. Мы демонстрируем обогащение этих очищенных ЦОНов, анализируя отдельные клетки для кNown маркеров стволовых клеток Oct4, Nanog, и Prom1 (CD133) и клеточной поверхности экспрессию CD177 и CD133. CSCs обладают повышенной химической устойчивости. Этот метод для изоляции ЦОНов является полезным инструментом для изучения роли ЦОНов в химиорезистентность и опухоли рецидива.

Введение

Resistance to chemotherapy is a major impediment to the treatment and cure of cancer. Ovarian cancer is the 5^th leading cause of cancer-related deaths among women in the United States (American Cancer Society Facts and Figures 2013). Patients initially respond well to chemotherapy, but most patients relapse¹. After relapse patients are treated with a variety of additional chemotherapy agents with very little benefit². General properties of CSCs include unlimited proliferative capabilities, retention of an undifferentiated state, resistance to drug treatment, efficient DNA repair, and ability to generate malignant tumor cells with different phenotypes³. CSCs frequently exhibit expression of stem cell genes such as Nanog, Oct4, Sox2, Nestin, CD133, and CD117. CSCs often express elevated levels of ABCG2, and ALDH genes that may contribute to drug efflux and metabolism^3,4.

The first definitive evidence for CSCs was demonstrated by isolating acute myeloid leukemia-initiating cells that were capable of self-renewal and tumor generation⁵. These leukemic stem cells expressed surface CD34 and generated leukemia in NOD/SCID (immunocompromised) mice⁵. Since then CSCs have been identified in many cancer types including leukemias/lymphomas, breast, bladder, colorectal, endometrial, sarcomas, hepatocellular carcinoma, melanomas, gliomas, ovarian, pancreatic, prostate, squamous cell carcinoma, and lung⁶. Therefore, being able to study this subtype of cancer cell is advantageous.

The goal of this study is to create a protocol for the selection and isolation of chemoresistant CSCs. Several methods have been reported for the isolation of CSCs from ovarian cancer cell lines. Non-adherent spheroids isolated from OVCAR-3, SKOV3, or HO8910 cultures demonstrate stem-like properties^7,8. Isolation of CD133+ cells from OVCAR-3 cultures also yields CSCs. CSCs have also been selected in culture by treatment with chemotherapeutic agents. Treating tumor cell lines (OVCA433, Hey, and SKOV3 cells) with cisplatin and paclitaxel allows for the expansion and isolation of CSCs^4,9. While culture of some cell types in CSC media leads to isolation of CSCs, SKOV3 cells did not survive culture in serum-free media or form sphere cells⁴. Therefore, treatment of cells with cisplatin and paclitaxel aided the expansion or isolation of this population⁴.

Using a modification of the procedure presented by Ma and colleagues⁴ we developed a method to isolate CSCs from the ovarian cancer cell lines. Our protocol is advantageous as it yields more viable cells while using less toxic chemotherapeutic agents. Cells are treated with cisplatin and subsequently grown in serum-free media supplemented with growth factors (stem cell media). We isolate the resulting non-adherent sphere cells and assay them for their expression of stem cell markers. This model enables the study of CSC properties and response to drug therapy.

протокол

1 Культура клеток и Флуоресцентная маркировка яичников линиях раковых клеток

1. Подготовка SKOV3 носитель: МакКой, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,1 мМ L-глутамина, 50 Ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина. Поддержание OVCA429 клеток в минимальной необходимой массовой информации (MEM) с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ L-глутамина, 50 Ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина.
2. Размножаются SKOV3 и OVCA429 клеточных линий в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С с 5% СО _2. Рост клеток в 40-50% слияния.
3. Генерация клетки, экспрессирующие красный флуоресцентный белок (RFP) в целях контроля за жизнеспособность в пробирке и в естественных условиях.
   1. Для генерации SKOV3 клетки, экспрессирующие RFP, добавить лентивирусов частиц выражения RFP и 10 мкг / мл полибрена к SKOV3 средах в отсутствие пенициллина и стрептомицина в течение 72 часов.
   2. После 72 часов, выберите для RFP-положительных клеток от клеток с возбуждением флуоресценции Sortiнг (FACS) следующим образом: Trypsinize RFP и не RFP выражая клетки, центрифуги при 125 мкг в течение 5 мин, ресуспендирования клеток в 10 ⁷ клеток / мл в PBS, содержащим 0,1% БСА. На мобильном сортировщика, использовать не RFP клетки для определения сортировки параметров. Тогда собрать клетки, которые выражают высокую ЗП, используя 561 нм лазер.
   3. С другой стороны, если лентивирусов плазмида экспрессирует антибиотик кассету сопротивления, выбрать для RFP экспрессирующих клеток при культивировании в соответствующий антибиотик (например, 10 мг / мл бластицидин). Примечание: объем лентивирусов частиц, который должен быть использован могут варьироваться в зависимости от партии и от типа клеток. Правильное лентивирусов титр должен быть определен для каждого типа клеток.

2 Обогащение раковых стволовых клеток

1. Лечить SKOV3, SKOV3-RFP, или OVCA429 клеточных линий 20 мкм цисплатина в течение 72 часов. ВНИМАНИЕ: Цисплатин является токсичным. Используйте защитную одежду / перчатки и избегать контакта с кожей и слизистых оболочек. Не выбрасывайте цисплатин Iн сточных вод.
2. Подготовьте носитель CSC: свободный DMEM / F12 массовой информации в сыворотке с добавлением 5 мкг / мл инсулина, 10 нг / мл человеческого рекомбинантного фактора роста эпидермиса (EGF), 10 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 12 нг / мл фактора ингибирования лейкемии , и 0,4% бычьего сывороточного альбумина (БСА).
3. Trypsinize клетки. Культура выживших клеток в CSC СМИ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После 2 дней в культуре неадгезивных сфероидов сформирует.
4. Изменение среды каждые 2 дня, собирая средой, содержащей клетки и центрифугированием при 125 х г в течение 5 мин. Тогда ресуспендируют осадок в пресной CSC СМИ. Проверьте клетки для жизнеспособности каждые 2 дня, считая клетки и выполнения трипанового синего.
5. Затем собирают CSCs для дальнейших экспериментов центрифугированием 129 х г в течение 5 мин и ресуспендирования осадка в фенол, содержащий гуанидина thiocynate (РНК), забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, и 11,9 мМ фосфатного буфера, рН 7,4) с 0,1% BSA (для проточной цитометрии), или CSC СМИ продолжатькультивирования клеток.
6. Монитор CSC морфологию клеток с помощью светового микроскопа на 20x и 40х увеличении.

3 CSC Характеристика помощью анализа экспрессии генов для маркеров стволовых клеток

1. Собирают 3 препараты CSCs путем сбора среды, содержащей клетки, центрифугированием при 129 х г в течение 5 мин и ресуспендирования осадка в растворе фенол, содержащий гуанидина thiocynate (могут быть использованы другие способы для экстракции РНК).
2. Подготовка общей РНК с помощью TRIzol соответствии с протоколом производителя. Синтезировать комплементарную ДНК (кДНК) от 0,1-1 мкг РНК с использованием коммерчески доступного обратной транскрипции кДНК комплект.
3. Выполнение количественного обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (QRT-PCR).
   1. Составляют основной смеси для каждого набора праймеров, содержащих QRT-PCR смесь, грунтовки, и вода до общего объема 8 мкл каждого образца (праймеры с различными флуорофоров может быть усилен в той же скважине). Например, генерируютодин хозяин смесь для Oct4-FAM, Nanog-Hex, и GAPDH-Cy5. Генерация отдельные главные миксов для нестин и Prom1. Добавить 2 мкл матрицы кДНК в образце.
      Примечание: В данном исследовании QRT-ПЦР проводили с использованием праймеров, перечисленных в таблице 1.
   2. Выполните все QRT-PCR в двух экземплярах для каждого образца с помощью ПЦР в реальном времени амплификаторе способный обнаруживать несколько флуорофоры. не включают элементы управления шаблона.
   3. Нормализовать гена клеток выражение штока к выражению GAPDH для каждого образца с помощью метода ΔΔC _T.

Oct-4-FAM	Праймер 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 '
	Праймер 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 '
	FAM зонд: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 '
Nanog-HEX	Праймер 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 '
	Праймер 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 '
	HEX зонд: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 '
GAPDH-Cy5	Праймер 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 '
	Праймер 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 '
	Cy5 зонд: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 '
Нестин-FAM	Праймер 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 '
	Праймер 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 '
	FAM зонд: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 '
CD133-HEX	Праймер 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 '
	Праймер 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 '
	HEX зонд: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3

Таблица 1 Праймеры, используемые для определения характеристик CSC по QRT-PCR.

e_title "> 4. Анализ ЦОК для сотового поверхностных маркеров CD117 и CD133

1. Урожай CSCs собирая среды, содержащие клетки и центрифугирования при 125 мкг в течение 5 мин. Добавить 500 мкл из не-протеолитической клеток отряда решение для распада клеток. Центрифуга клетки при 125 мкг в течение 5 мин для удаления клеток отряд решение. Затем промыть клетки дважды холодным ФСБ.
2. Инкубировать в нормальном питательной среды в течение 1 часа до маркировки клеток. Спин вниз клетки в течение 5 минут при 129 х г в. Ресуспендируют клеток в PBS с 0,1% BSA с анти-CD133-PE и анти-CD117-FITC.
3. Fix клеток в течение ночи в 1% параформальдегиде. Внимание: Параформальдегид токсичен (канцероген). Сделайте в вытяжном шкафу и использовать в течение недели.
4. Выполните проточной цитометрии для анализа CD117 (с анти-CD117, конъюгированного с FITC) и CD133 (с анти-CD133, конъюгированное с РЕ) на клеточной поверхности выражением на проточной цитометрии. Сбор данных на клетки в FL1 (для FITC) и FL3 (для ПЭ) каналов. Генерация ворота для клеток, экспрессирующих какFITC и PE. Создайте точечный участок с 4 квадранта (FITC- и ПЭ, FITC + ПЭ, FITC- PE + и FITC + и PE +) и определить количество клеток в каждом квадранте.

5 Анализируя CSCs для терапевтического ответа

1. Plate 5000 клеток на лунку (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3 CSC и SKOV3-RFP ЦОНов) на 96-луночных планшетах на ночь.
2. Treat с цисплатином (0, 1, 10, 100, и 1000 мкм) или паклитаксел (0, 0,01, 0,1, 1, 10 и 100 мкМ) в течение 96 часов.
3. Выполнение МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид) жизнеспособность клеток для анализа.
   1. Пластинчатые 5000 клеток на 100 мкл на лунку на 96-луночный планшет (пластинчатые элементы в двух экземплярах и включать в себя носители только контрольные лунки).
   2. После 24 часов, добавляют 10 мкл 10 мг / мл МТТ. Инкубируют при 37 ° С в течение 2-4 ч (до осадка форм).
   3. Добавить 100 мкл МТТ растворителя 4мМ HCl, 0.1% NP-40 в изопропанола. Выдержите в течение 15 мин в темноте.
   4. Читайте пластин при 570 нм на тарелке гeader.

Результаты

Чтобы продемонстрировать, что мы изолированы CSCs из эпителиальных клеточных линий рака яичников с помощью лечение цисплатином, сначала полученных изображений из клеточных линий до обработки и после отбора. Мы использовали световой микроскопии для захвата изображений приверженца (нео...

Обсуждение

ЦОК, которые устойчивы к терапии может нести ответственность за рецидив после лечения первичной опухоли. Характеристика ЦОНов может привести к улучшению лечения для рака яичников. Критические параметры в создании химиорезистентных ЦОНов с вышеприведенной схемой являются временными...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy	Life Technologies	16600-108	Warm to 37 °C prior to use
DMEM / F12 serum free	Life Technologies	11320-033	Warm to 37 °C prior to use
Minimal Essential Media	Life Technologies	42360032	Warm to 37 °C prior to use
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360070
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Blasticidin	Life Technologies	R21001
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15070-063
Cisplatin	Sigma-Aldrich	T7402-5MG	Caution: Toxic. Use precautions
pLenti-suCMV-Rsv	Gentarget	LVP023	BSL2 approval needed
Insulin	Sigma-Aldrich	I-1882
Human Recombinant EGF	Cell Signaling Technology	8916LC
bFGF	BD biosciences	354060
LIF	Santa Cruz	sc-4988A
Bovine Serum Albumin	Roche	03 116 956 001
TRIzol	Life Technologies	15596-018
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
IQ Multiplex Powermix	BioRad	1725849
Accumax	Millipore
Primers	Integrated DNA Technology	individually designed and ordered (see protocol for sequnces)
Anti-CD133 PE	Milenyl	130-098-826	Primer/probe sets are light sensitive
CD117-Biotin	Miltenly	130-098-570
AntiBiotin-FITC	Miltenly	130-098-796
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh.
Trypsin	Life Technologies	25300062
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)	Sigma-Aldrich	25200-072
EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope	Advanced Microscopy Group
Biorad CFX96 C1000 System	Biorad
Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer	Beckman Coulter
Spectramax 340PC384	Molecular Devices