JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا علينا أن نظهر الكمي لاجتثاث الشبكية وتجديد وأثره على وظيفة البصرية باستخدام N -methyl- N -nitrosourea في الزرد الكبار. وتلت فقدان البصر وانخفضت أعداد مبصرة من انتشار في الطبقة النووية الداخلية. وقع تجديد كامل المورفولوجية والوظيفية بعد 30 يوما من العلاج الأولي.

Abstract

أمراض الشبكية التنكسية، مثل التهاب الشبكية الصباغي، مع ما يترتب على حساب الضرر مبصرة لغالبية فقدان البصر في العالم الصناعي. النماذج الحيوانية ذات أهمية محورية لدراسة مثل هذه الأمراض. في هذا الصدد السم مبصرة محددة N -methyl- N -nitrosourea (MNU) وقد استخدم على نطاق واسع في القوارض للحث على دواء تنكس الشبكية. سابقا، أنشأنا نموذجا تنكس الشبكية الناجم MNU في الزرد، ونظام آخر نموذج شعبية في البحث البصري.

وهناك فرق رائعة على الثدييات هو تكوين الخلايا العصبية الكبار المستمر في شبكية العين الزرد وتجديد لها بعد الضرر. لتحديد هذه الملاحظة لقد استخدمنا قياسات حدة الإبصار في الزرد الكبار. وبالتالي، تم استخدام منعكس حركة العين لمتابعة التغييرات الوظيفية في الأسماك غير تخدير. واستكمل هذا مع الأنسجة وكذلك staini المناعىنانوغرام لموت الخلايا المبرمج (النفق) وانتشار (PCNA) لربط التغيرات المورفولوجية النامية.

باختصار، موت الخلايا المبرمج للخلايا مستقبلة للضوء يحدث بعد ثلاثة أيام العلاج MNU، والذي يليه انخفاض ملحوظ من الخلايا في الطبقة الخارجية النووية (ONL). بعد ذلك، لوحظ تكاثر الخلايا في الطبقة النووية الداخلية (INL) وONL. هنا، نحن تكشف أن ليس فقط النسيجية كاملة ولكن أيضا حدوث تجديد وظيفية على مدار الساعة من 30 يوما. نحن الآن توضيح الأساليب لقياس ومتابعة اجتثاث الشبكية الزرد وتجديد باستخدام MNU في تنسيق الفيديو.

Introduction

الرؤية هي الشعور الأكثر أهمية للإنسان وضعف لها أثر اجتماعي واقتصادي عال. في العالم المتقدم، والأمراض التنكسية الشبكية هي السبب الرئيسي لفقدان البصر والعمى بين كبار السن 1. يفهم سبب معظم الأمراض التنكسية الشبكية جزئيا فقط، والحلول العلاجية لاستعادة الرؤية المفقودة محدودة جدا. التهاب الشبكية الصباغي هو مثال نموذجي من الأمراض التنكسية الشبكية مع فقدان مبصرة الأولية 2-3. -methyl- N N -nitrosourea (MNU) يدفع تنكس الشبكية، وبالتالي يستخدم على نطاق واسع في القوارض لنموذج الأمراض مع خلية مستقبلة للضوء الرئيسي فاة 4. وهي وكيل مؤلكل ويؤدي إلى الأورام الحميدة والخبيثة، التي تظهر عادة بعد عدة أشهر من التعرض 5-7. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتسبب موت الخلايا مبصرة محددة ضمن فترة المراقبة على المدى القصير. وبالتالي، فقدان طبقة الشبكية structuوإعادة وحظت ترقق الشبكية كبير بطريقة تعتمد على التركيز. تم تنشيط الخلايا الدبقية الشبكية، ولكن لا توجد تغييرات في الظهارة الصبغية الشبكية (RPE). شبكية هيولي باطني (ER) الخلايا المرتبطة بالتوتر ويبدو أن المسار الرئيسي للعمل MNU في شبكية العين 8.

أدخلنا مؤخرا MNU كنموذج الكيميائية للحث على انحطاط مستقبلة للضوء في الزرد 9. من بين أسباب أخرى، أصبح الزرد (دانيو rerio) مهم في البحث البصري بسبب التشابه نظامها البصري إلى أن من الفقاريات الأخرى 10. شبكية العين تحتوي على المستقبلات الضوئية الخارجية، التي يمكن تصنيفها إلى أربعة أنواع مختلفة مع مخروط الحساسيات الذروة في الأشعة فوق البنفسجية، قصيرة، متوسطة، وطويلة الطول الموجي من الطيف المرئي وقضيب واحد نوع مبصرة. في الطبقة النووية الداخلية (INL)، وعثر على جثث خلية من القطبين، الأفقي، وinterneurons عديم الاستطالات، وأهلا وسهلال كما سوما خلية من خلايا الدبقية مولر. في طبقة ضفيري الخارجي (اوبل) تتشكل الاتصالات متشابك بين المستقبلات الضوئية في شبكية العين والداخلية، في حين أن طبقة الخلايا الأقرب إلى العدسة هي طبقة الخلايا العقدية (GC)، المكونات التي تشكل محاور عصبية طويلة تضم العصب البصري والجهاز البصري . وتشكل الاتصالات المشبكية بين الخلايا العقدية والخلايا في الطبقة النووية الداخلية في طبقة ضفيري الداخلية (IPL) 11. وRPE تقع خارج الشبكية العصبي الحسي ويحيط شرائح مبصرة الخارجي مع زغيبات قمية طويلة 12. وعلاوة على ذلك، الزرد هو التجديدي للغاية وقادرة على تنمو الدماغ lesioned، شبكية العين، والحبل الشوكي والقلب والأنسجة الأخرى 13. عندما يحدث تلف في شبكية العين، والخلايا في INL، والتي يعتقد أن خلايا مولر، يتم تنشيط ولها القدرة على التمايز إلى مختلف أنواع الخلايا في شبكية العين. وبالإضافة إلى ذلك، كما أنها تولد قضيب الأسلاف، والتي تقع في ONL. حتى آخرurce التي تزود الشبكية من الزرد الكبار مع خلايا جديدة هو منطقة هامشية الهدبية. وهناك حاجة لتحقيق هذا المصدر كثافة مستمرة من المستقبلات الضوئية قضيب في العين الزرد تزايد مستمر 14.

نموذج MNU يمكن استخدام نهج الضمور / تجديد بسيطة وقابلة للتكرار للأنسجة الشبكية. بسبب التشابه معينة من العمليات البيولوجية في الزرد والبشر هذا يمكن أن يفتح الأبواب لتحديد مسارات موت الخلايا المعنية لفحص المخدرات واعصاب المحتملة. واستنادا إلى دراسة سابقة من مجموعتنا، ونحن الآن توضيح أساليب هذا النموذج الزرد MNU التي يسببها من اجتثاث الشبكية وما يترتب تجديد بما في ذلك التغيرات الوظيفية وفقا أشرطة الفيديو مع مختبر 9.

Protocol

جميع التجارب انضمت إلى بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية لجمعية أبحاث طب العيون في الرؤية و(ARVO).

1. الحيوانات

  1. الحفاظ على النوع البري الزرد (دانيو rerio) من AB (أوريغون) سلالة الذين تتراوح أعمارهم بين 6-12 شهرا في ظل ظروف قياسية في المياه مع درجة حرارة 26.5 درجة مئوية و14/10 ضوء ساعة / دورة الظلام 15.
  2. اتباع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من المؤسسات المعنية للالتجارب على الحيوانات بعد موافقة المكتب البيطري الكانتونات.

2. MNU العلاج

  1. تعد المياه التي تحتوي على 150 ملغ / لتر من المادة الجافة N -methyl- N -nitrosourea (MNU). تنبيه! MNU سامة. قد تسبب السرطان، والضرر الجيني الموروثة أو أذى للطفل الذي لم يولد بعد.
  2. احتضان الزرد في المياه التي تحتوي على MNU لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. شطف الزرد بسرعة معالمياه العذبة ووضع الأسماك إلى حوض للأسماك الجديد دون MNU. الحفاظ على الأسماك تحت ظروف قياسية طالما المرجوة للتجارب.

3. قياس حدة البصر

  1. بدء نظام optomotor، اختر 'اختبار' من القائمة وتعيين الخيارات ل"الدرج بسيط"، "البراعة (التكرار)" و "العشوائية / منفصلة" 16.
  2. تثبيت زجاجة مليئة ضخ 500 مل من الماء حوالي 1 متر فوق النظام optomotor.
  3. وضع الزرد واحد في غرفة الفحص وتوصيله إلى زجاجة التسريب. وضع غرفة الفحص في النظام optomotor.
  4. بدء قياس ومراقبة حركة العين في الوقت الحقيقي على شاشة الكمبيوتر. وبالتالي، يتم تعريف ردا إيجابيا ("نعم") كما saccades متتالية في الاتجاه الصحيح، في حين أن الاستجابة السلبية ("لا") يمثل حركات العين العشوائية مماثلة لتلك التي لوحظت مع محطةحواجز شبكية آرى. إذا كانت العينان من المعرض الزرد ثلاثة أو أكثر من الردود اللاحقة عينية حركية (OKR)، اضغط على 'نعم'؛ إن لم يكن، اضغط على "لا".
  5. استخراج حدة البصر، والتي تم حسابها بواسطة البرنامج عن طريق تحديد عتبة التردد المكاني للتحفيز حركة العين، تحت عنوان "نتائج" في القائمة.

4. علم الأنسجة

  1. الموت ببطء الزرد بواسطة جرعة زائدة من إيثيل 3 أمينوبنزوات methanesulfonate (200-300 ملغم / لتر) واستأصل العينين.
  2. إصلاح العيون كلها في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ثم يذوى العينات في سلسلة متدرجة الكحول.
  3. تضمين العينات في البارافين، وقطع 5 ميكرون من خلال أقسام رأس العصب البصري (ONH) وجبل لهم على الشرائح الزجاجية.
  4. وصمة عار على أقسام البارافين deparaffized مع شب هيماتوكسليني لمدة 4 دقائق وتراجع الشرائح مرتين في الماء المقطر تليها 0.2٪ ACI الهيدروكلوريكد و 0.8٪ الأمونيا. وصمة عار على أقسام مع يوزين لمدة 3 دقائق بعد تطوير تلطيخ شب هيماتوكسليني توجد فى ماء الصنبور لمدة 10 دقيقة على الأقل (H & E).
  5. تضمين الشرائح المجففة في تصاعد المتوسطة ومراقبة الشرائح تحت المجهر الضوئي.

5. المناعية

  1. محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز dUTP نيك وسم نهاية (النفق)
    1. احتضان أقسام deparaffinized مع 20 ميكروغرام / مل K بروتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. غسل أقسام ثلاث مرات مع تريس مخزنة المالحة (TBS) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    2. احتضان المقاطع مع 50 ميكرولتر خليط التفاعل النفق (10٪ محلول وضع العلامات و 90٪ محلول أنزيم) في غرفة ترطيب عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. يغسل ثلاث مرات مع TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    3. جبل الشرائح مع تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي ومراقبة الشرائح تحت المجهر مضان.
  2. المتكاثرة خلية مستضد النووية (PCNA) تلطيخ
    1. تغلي الأقسام deparaffinized في المخزن استرجاع مستضد (تريس، EDTA + 0.05٪ توين 20، ودرجة الحموضة 9.0) لمدة 3 دقائق ويغسل ثلاث مرات مع TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. منع مع 100 ميكرولتر عرقلة الحل (TBS + 10٪ الماعز العادي المصل + 1٪ ألبومين المصل البقري، pH7.6) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    2. وصمة عار مع مكافحة PCNA الأجسام المضادة الأولية في 1: 200 التخفيف في غرفة ترطيب عند 4 درجات مئوية خلال الليل. يغسل ثلاث مرات مع TBS + توين 20 لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    3. إنهاء الكشف مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في 1: 500 التخفيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    4. جبل الشرائح مع تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي ومراقبة الشرائح تحت المجهر مضان.

النتائج

البصرية حدة:

التجريبية مجموعة المتابعة [التردد المكاني: 0.042 الدوائر / درجة (C / D). النقيض: 100٪؛ سرعة الانجراف: 20 درجة / ثانية (د / SRC). العودة الخفيفة الإنارة: 152 شمعة / م 2] من هذه الدراسة مكنت تقييم OKR من الزرد الكبار. كان متوسط ​​مدة...

Discussion

سابقا، وقد نقل مجموعتنا نموذج MNU انحطاط مبصرة من القوارض في النظام الزرد 9. ووصف الأحداث التي تلت ذلك ويتبع لمدة تصل إلى 30 يوما. في هذه الفترة الزمنية حدث انحطاط كامل الصرفي الشبكية وتجديد بعد العلاج الأولي. أولا، الأنسجة تكشف خلية قضيب خفض العد من اليوم على 3 مع ح...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidSigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandA6283
AmmoniaSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland2949930.80%
Bovine serum albumine (BSA)Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland05470
Dako PenDako, Glostrup, DanmarkS2002
DAPI mounting mediumVector Labs, Burlingame, CA, USAH-1200
EosinSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland45260
EthanolSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland2860100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate saltSigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandE10521Tricaine
EukittSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland3989
Goat anti-rabbit Alexa 594Life Technologies, Zug, Switzerland A11012
Goat normal serumDako, Glostrup, DanmarkX0907
Hydrochloric acidSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland3203310.20%
In situ Cell Death Detection KitRoche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland11684795910TUNEL Kit
Mayer's hemalum solutionMerck, Darmstadt, Germany109249
Methylnitrosourea (MNU)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandN4766Toxic
OptoMotryCerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canadan.a.
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP6148
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP5368
Proteinase KDako, Glostrup, DanmarkS3004
Rabbit anti-PCNA Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USAsc-33756
Superfrost Plus glass slidesGehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany10149870
Tris buffered saline (TBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP5912
Trizma baseSigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandT1503
Tween 20Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP1379
XyleneSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strainUniversity of Fribourg, Dept. of Biologyn.a.Own fish facility

References

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
  2. Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
  3. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
  4. Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
  5. Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura, T., Usui, Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
  6. Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
  7. Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
  8. Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
  9. Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
  10. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
  11. Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
  12. Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
  13. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  14. Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
  15. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
  16. Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10 (2012).
  17. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
  18. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  19. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  20. Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
  21. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  22. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  23. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

92 N N MNU

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved