Méthylnitrosourée (MNU) induite par dégénérescence rétinienne et la régénération dans le poisson zèbre: caractéristiques histologiques et fonctionnelles

Résumé

Ici, nous démontrons la quantification des ment de la rétine et de la régénération et de son impact sur ​​la fonction visuelle en utilisant la N -nitrosourea de N chez le poisson zèbre adulte. Baisse de l'acuité visuelle et une diminution du nombre de photorécepteurs ont été suivis par une prolifération dans la couche nucléaire interne. Régénération morphologique et fonctionnelle complète a eu lieu 30 jours après le traitement initial.

Résumé

Maladies dégénératives de la rétine, par exemple, la rétinite pigmentaire, avec des dommages de photorécepteur compte résultant pour la plupart de la perte de vision dans le monde industriel. Les modèles animaux sont d'une importance cruciale pour étudier ces maladies. À cet égard, la toxine spécifique photorécepteur N de -nitrosourea de N (MNU) a été largement utilisé chez les rongeurs pour induire pharmacologiquement dégénérescence rétinienne. Auparavant, nous avons établi un modèle de dégénérescence rétinienne MNU-induite chez le poisson zèbre, un autre système de modèle populaire dans la recherche visuelle.

Une différence fascinant pour les mammifères est la neurogenèse persistante chez l'adulte rétine de poisson zèbre et sa régénération après une lésion. Pour quantifier cette observation, nous avons utilisé des mesures de l'acuité visuelle chez le poisson zèbre adulte. De ce fait, le réflexe optocinétique a été utilisé pour suivre les changements fonctionnels chez les poissons non-anesthésié. Ceci a été complété par l'histologie ainsi que staini immunohistochimiqueng de l'apoptose (TUNEL) et la prolifération (PCNA) afin de corréler les changements morphologiques en développement.

En résumé, l'apoptose des photorécepteurs se produit trois jours après le traitement MNU, qui est suivie par une réduction marquée de cellules dans la couche nucléaire externe (ONL). Par la suite, la prolifération des cellules de la couche nucléaire interne (INL) et ONL est observée. Ici, nous révélons que non seulement une complète histologique mais aussi une régénération fonctionnelle se produit sur un parcours de temps de 30 jours. Maintenant, nous illustrons les méthodes de quantification et le suivi ment de la rétine de poisson zèbre et la régénération utilisant MNU dans une vidéo au format.

Introduction

Vision est le sens le plus essentiel pour l'être humain et sa dépréciation a un impact socio-économique élevé. Dans le monde développé, les maladies dégénératives de la rétine sont la principale cause de perte de vision et de cécité chez les personnes âgées ^1. La cause de la plupart des maladies dégénératives de la rétine n'est que partiellement comprise et solutions thérapeutiques pour retrouver la vision perdue sont très limitées. La rétinite pigmentaire est un exemple typique d'une maladie dégénérative de la rétine avec une perte des photorécepteurs primaire ^2-3. N-méthyl-N -nitrosourea (MNU) induit la dégénérescence rétinienne et est donc largement utilisée chez les rongeurs pour modéliser les maladies avec photorécepteur primaire mort cellulaire ^4. Il s'agit d'un agent d'alkylation et conduit à des tumeurs bénignes et malignes, qui apparaissent habituellement plusieurs mois après l'exposition ^7.5. En outre, il provoque photorécepteur spécifique de mort cellulaire dans une période d'observation de courte durée. De ce fait, la perte de la couche rétinienne structure et l'amincissement de la rétine significative a été observée d'une manière dépendante de la concentration. Les cellules gliales de la rétine ont été activés, mais aucun changement dans l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) ont été trouvés. Réticulum endoplasmique (ER) de l'apoptose liée au stress semble être la principale voie d'action MNU dans la rétine ^8.

Nous avons récemment introduit MNU comme un modèle chimique pour induire une dégénérescence des photorécepteurs chez le poisson zèbre ^9. Parmi d'autres raisons, le poisson zèbre (Danio rerio) a pris de l'importance dans la recherche visuelle en raison des similitudes de son système visuel à celle des autres vertébrés ^10. La rétine externe contient les photorécepteurs, qui peuvent être regroupés en quatre types de cônes différents avec des sensibilités de pointe dans l'ultraviolet, à court, moyen et à long longueur d'onde du spectre visible et une tige type de photorécepteur. Dans la couche nucléaire interne (INL), les corps cellulaires des bipolaires, horizontales et amacrines interneurones se trouvent, comme well en tant que corps cellulaire des cellules gliales Muller. Dans la couche plexiforme externe (OPL) des contacts synaptiques entre les photorécepteurs et la rétine interne sont formées, tandis que la couche cellulaire la plus proche de la lentille est la couche des cellules ganglionnaires (GC), les composants qui forment de longs axones comprenant le nerf optique et la bandelette optique . Des contacts synaptiques entre les cellules ganglionnaires et les cellules de la couche nucléaire interne sont formées dans la couche plexiforme interne (IPL) ^11. L'EPR est en dehors de la rétine neurosensorielle et entoure les segments externes des photorécepteurs avec longues microvillosités apicale ^12. En outre, le poisson zèbre est très régénérative et en mesure de repousser cerveau lésé, la rétine, la moelle épinière, le cœur et d'autres tissus ^13. Lorsque se produit une lésion rétinienne, les cellules dans la INL, qui l'on pense être les cellules de Müller, sont activés et ont le potentiel de se différencier en différents types de cellules rétiniennes. De plus, ils produisent également des progéniteurs de la tige, qui sont situés dans l'ONL. Une autre manièreurce qui fournit la rétine de poisson zèbre adulte avec de nouvelles cellules est la zone marginale ciliaire. Cette source est nécessaire pour obtenir une densité constante de photorécepteurs de la tige dans le poisson zèbre œil croissance continue ^14.

La MNU modèle peut être utilisé comme une approche simple et reproductible dégénérescence / régénération de tissu rétinien. En raison de certaines similitudes entre les processus biologiques chez le poisson zèbre et chez l'homme ce qui pourrait ouvrir les portes à identifier impliqués voies de mort cellulaire et de cribler des médicaments potentiellement neuroprotecteurs. Basé sur une étude précédente de notre groupe, nous illustrons maintenant les méthodes de ce modèle de poisson zèbre MNU induite par ment de la rétine et la régénération conséquente y compris les changements fonctionnels avec selon laboratoire vidéos ^9.

Protocole

Toutes les expériences ont adhéré à la Déclaration de l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO).

1. Animaux

1. Maintenir le poisson zèbre de type sauvage (Danio rerio) de la souche AB (Oregon) âgés de 6-12 mois dans des conditions standard dans l'eau avec une température de 26,5 ° C et un 14/10 h cycle lumière / obscurité ^15.
2. Suivez les directives de protection des animaux des établissements concernés pour les expériences sur les animaux après l'approbation par l'Office vétérinaire cantonal.

2. Traitement MNU

1. Préparez de l'eau contenant 150 mg / L de matière sèche de la N -nitrosourea de N (MNU). ATTENTION! MNU est toxique; peut causer le cancer, des dommages génétiques héréditaires ou néfastes pour l'enfant à naître.
2. Incuber le poisson-zèbre dans de l'eau contenant le MNU pendant 60 min à température ambiante.
3. Rincez le poisson zèbre rapidement avecl'eau douce et de mettre le poisson à un nouveau réservoir de poissons sans MNU. Maintenir le poisson dans des conditions standard aussi longtemps que désiré pour les expériences.

3. acuité mesure

1. Démarrez le système optomoteur, choisissez «testing» dans le menu et définissez les options pour "Escalier simple», «Acuity (Freq)» et «randomisés / indépendante» ^16.
2. Installez une bouteille de perfusion remplie de 500 ml d'eau environ 1 m au-dessus du système de optomoteur.
3. Placez un poisson zèbre dans la chambre d'examen et le connecter à la bouteille de perfusion. Placer la chambre d'examen dans le système optomoteur.
4. Lancer la mesure et observer le mouvement de l'œil en temps réel sur l'écran de l'ordinateur. Ainsi, une réponse positive ("oui") est défini comme saccades consécutives dans le bon sens, alors qu'une réponse négative («non») représente les mouvements aléatoires des yeux semblables à ceux observés avec la stationréseaux aires. Si les yeux de l'exposition du poisson zèbre trois ou plusieurs réponses optocinétiques ultérieures (OKR), appuyez sur «oui»; sinon, appuyez sur «non».
5. Extrait de l'acuité visuelle, qui a été calculé par le logiciel en déterminant le seuil de la fréquence spatiale de la stimulation optocinétique, dans "Résultats" dans le menu.

4. histologie

1. Euthanasier le poisson zèbre par une surdose d'éthyle 3-aminobenzoate méthanesulfonate (2-300 mg / L) et énucléer les yeux.
2. Fixer les yeux entiers dans 4% de paraformaldehyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C pendant 12 heures et ensuite déshydrater les échantillons dans une série graduée d'alcool.
3. Intégrer les échantillons dans de la paraffine, couper 5 um sections à travers la tête du nerf optique (TNO) et les monter sur une lame de verre.
4. Colorer les coupes de paraffine deparaffized avec Hémalun pendant 4 min et plongez les lames deux fois à l'eau distillée puis de 0,2% aci chlorhydriqued et 0,8% d'ammoniac. Colorer les sections avec de l'éosine pour 3 mn après le développement de la coloration à l'hémalun dans l'eau du robinet pendant au moins 10 min (H & E).
5. Intégrer les diapositives déshydratés dans un milieu de montage et d'observer les lames au microscope optique.

5. immunohistochimie

1. Désoxynucléotidyltransférase Terminal dUTP nick étiquetage de fin (TUNEL)
   1. Incuber les sections déparaffinées avec 20 ug / ml de protéinase K à la température ambiante pendant 15 min. Laver les sections trois fois avec une solution saline tamponnée Tris (TBS) pendant 5 minutes chacun.
   2. Incuber les sections du mélange de réaction de 50 ul TUNEL (marquage de la solution de 10% et une solution d'enzyme à 90%) dans une chambre humidifiée à 37 ° C pendant 60 min. Laver trois fois avec du TBS pendant 5 minutes chacun.
   3. Monter les lames avec un milieu contenant DAPI de montage et d'observer les lames au microscope à fluorescence.
2. Cellulaire antigène nucléaire (PCNA) coloration
   1. Faire bouillir les sections déparaffinées dans du tampon de récupération d'antigène (Tris-EDTA + 0,05% de Tween 20, pH 9,0) pendant 3 minutes et laver trois fois avec du TBS pendant 5 minutes chacun. Bloquer avec 100 ul de solution (TBS + 10% sérum de chèvre + 1% d'albumine de sérum de bovin normal, pH 7,6) à la température ambiante pendant 1 heure blocage.
   2. Colorer avec des anticorps primaires anti-PCNA dans une dilution 1: 200 dans une chambre humidifiée à 4 ° C pendant une nuit. Laver trois fois avec du TBS + Tween 20 pendant 5 minutes chacun.
   3. Terminer la détection avec des anticorps secondaires appropriés à une dilution de 1: 500 à température ambiante pendant 1 heure.
   4. Monter les lames avec un milieu contenant DAPI de montage et d'observer les lames au microscope à fluorescence.

Résultats

Acuité visuelle:

Le dispositif expérimental [de fréquence spatiale: 0.042 cercles / degré (c / d); contraste: 100%; vitesse de dérive: 20 degrés / seconde (d / src); retour luminance lumineuse: 152 cd / m ^2] de cette étude a permis évaluation Oberkirchenrätin de poisson zèbre adulte. La durée moyenne de mesure VA était d'environ 5 - 10 minutes pour chaque poisson zèbre, qui bien toléré la procédure. L'acuité visuelle avant l'exposition MNU était 0,577...

Discussion

Auparavant, notre groupe a transféré le modèle MNU de dégénérescence des photorécepteurs de rongeurs dans le système poisson-zèbre ^9. Les événements qui ont suivi ont été décrits et suivis pendant 30 jours. En cette période de dégénérescence rétinienne morphologique complet et la régénération se sont produits après le traitement initial. Tout d'abord, l'histologie révèle une cellule de tige réduite compter du jour 3 avec un minimum à jour 8 En conséquence, la coloration TUN...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A6283
Ammonia	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	294993	0.80%
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	05470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	45260
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860	100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	E10521	Tricaine
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit Alexa 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11012
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	320331	0.20%
In situ Cell Death Detection Kit	Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland	11684795910	TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution	Merck, Darmstadt, Germany	109249
Methylnitrosourea (MNU)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	N4766	Toxic
OptoMotry	CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada	n.a.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Proteinase K	Dako, Glostrup, Danmark	S3004
Rabbit anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA	sc-33756
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Trizma base	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	T1503
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain	University of Fribourg, Dept. of Biology	n.a.	Own fish facility