Methylnitrosourea（MNU）诱导的视网膜变性和再生的斑马鱼:组织学和功能特征

摘要

在这里我们展示视网膜脱离和再生，对以N甲基 -N- -nitrosourea在成年斑马鱼的视觉功能的影响进行量化。其次是在内核层扩散视力丧失和降低光感受器号。发生完整的形态和功能恢复的初步治疗后30天。

摘要

视网膜退行性疾病， 如视网膜色素变性，用得到的，为广大视力下降，在工业领域感光伤害帐户。动物模型是至关重要的意义，研究这种疾病。在这方面，在感光体特异性毒素N-甲基-N- -nitrosourea（MNU）已被广泛用于在啮齿动物药理学诱导的视网膜变性。此前，我们已经建立了MNU诱导的视网膜变性模型中的斑马鱼，在视觉研究的另一种流行的模型系统。

一个迷人的区别是哺乳动物在成年斑马鱼视网膜损伤后的再生持续神经。为了量化这一观察，我们在成年斑马鱼使用视力的测量。由此，视动反射被用于跟随在非麻醉的鱼的功能变化。这补充了组织学以及免疫staini吴凋亡（TUNEL）和增殖（PCNA）关联的发展形态变化。

综上所述，光感受器细胞凋亡MNU治疗，随后是细胞中的外核层（ONL）的显着降低三天之后出现。此后，将细胞在内核层（INL）和ONL的增殖被观察。在此，我们表明，不仅是一个完整的组织，而且功能性再生发生在30天的时间过程。现在我们说明的方法来量化和跟进的视频格式使用的MNU斑马鱼视网膜脱离和再生。

引言

视觉是最重要的意义的人及其损害具有较高的社会经济影响。在发达国家，视网膜变性疾病是视力减退和失明的老年人中¹的主要原因。最退行性视网膜疾病的原因只是部分了解和治疗方案，以夺回失去的视力是非常有限的。视网膜色素变性是视网膜变性疾病的原发性感光损失^2-3。n的典型例子甲基 -N -nitrosourea（MNU）诱导的视网膜变性，因此被广泛应用在啮齿类动物模型与主光感受器细胞死亡⁴疾病。它是一种烷化剂，并导致良性和恶性肿瘤，通常会出现曝光^5-7后几个月。此外，它会导致短期的观察期间内特定光感受器细胞死亡。由此，视网膜层structu的损失重和显著视网膜变薄了以浓度依赖性方式观察到。视网膜神经胶质细胞被激活，但在视网膜色素上皮细胞（RPE）没有变化被发现。内质网（ER）应激相关的细胞凋亡似乎是MNU作用的主要途径在视网膜^8。

我们最近推出的MNU作为一种化学模型诱导光感受器变性斑马鱼^9。除了 ​​其他原因，斑马鱼（ 斑马鱼 ）已成为因为它的视觉系统对其他脊椎动物¹⁰的相似之处在视觉研究很重要。外层视网膜包含感光体，它可被分成四个不同的锥面类型具有峰值灵敏度的紫外线，短，中等，和可见光谱的长波长和一个视杆型。在内核层（INL）的双极性，水平和无长突的interneurons细胞体被发现，如WELl与穆勒胶质细胞的胞体。在所述外丛状层（OPL）的光感受器和视网膜内层之间的突触联系形成的，而最接近透镜的细胞层是神经节细胞层（GC），该组件形成长轴突包括视神经和视束。神经节细胞和细胞中的内核层之间的突触联系形成于内网层^{（IPL）11。}视网膜色素上皮所在的视网膜神经上皮层外，并围绕光感受器外段长微绒毛顶端^12。此外，斑马鱼是高度再生，并能够再生毁损脑，视网膜，脊髓，心脏和其他组织^13。当视网膜损伤时，细胞中的INL，这被认为是Müller细胞，被激活并具有分化成多种视网膜细胞类型的潜力。此外，它们还产生棒祖细胞，它们分别位于外核层。另一个让urce供给成年斑马鱼视网膜有新生细胞的纤毛边缘区。这个源是需要实现的视杆细胞的恒定密度的不断增长的斑马鱼眼^14。

在MNU模型可以用作视网膜组织的简单和可再现的变性/再生方法。由于在斑马鱼中的生物过程的某些相似性和在人体中，这可能打开门，以确定参与细胞死亡途径，筛选潜在的神经保护药物。根据我们组先前的研究，我们现在说明这MNU诱导斑马鱼视网膜脱离和随之而来的再生包括根据实验室影片⁹功能变化模型的方法。

研究方案

所有实验坚持以声明的动物眼科及研究协会在视觉视觉研究与眼科（ARVO）使用。

1，动物

1. 维持公司（俄勒冈州）水标准条件下6-12个月之间以26.5℃的温度和14/10小时的光/暗周期¹⁵株野生型斑马鱼（ 斑马鱼 ）。
2. 按照参与机构的审批由州兽医局后，经动物实验动物照护指引。

2，MNU处理

1. 制备含有氮甲基 -N- -nitrosourea（MNU）150毫克/升干燥物质的水。注意！ MNU是有毒的;可能会导致癌症，遗传性的损害或伤害胎儿。
2. 孵育斑马鱼中含有MNU，在室温下60分钟的水。
3. 迅速用清水冲洗斑马鱼淡水把鱼到一个新的鱼缸没有MNU。维持标准的条件，只要所需的实验下的鱼。

3，视力测量

1. 启动optomotor系统，从菜单中选择"测试"，并设置选项，以"简单楼梯"，"视力（频率）"和"随机/独立^"16。
2. 安装的输液瓶填充500ml水约1μm的optomotor系统之上。
3. 将一个斑马鱼在考试室，并把它连接到输液瓶。放置在optomotor系统的检查室。
4. 开始测量和观察计算机屏幕上实时眼球运动。因此，积极响应（"是"）被定义为连续扫视了正确的方向，而一个否定的答复（"无"）代表随机眼球运动相似，与那些观测站进制光栅。如果斑马鱼表现出的眼里三个或更多的后续视动反应（OKR），按"是";如果没有，请按"不"。
5. 提取的视力，其中已计算由软件通过确定视动刺激的空间频率的阈值时，根据菜单中的"结果"。

4，组织学

1. 由乙基3 - 氨基苯甲酸酯（200-300毫克/升）的过量安乐死斑马鱼和去核的眼睛。
2. 在4℃下12小时固定整个眼睛用4％多聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后脱水的样品在梯度醇系列。
3. 嵌入样品中石蜡，切5微米的部分通过视神经乳头（ONH）和它们安装在载玻片上。
4. 染色deparaffized石蜡切片用hemalum为4分钟，浸在幻灯片两次蒸馏水中后0.2％的盐酸ACID和0.8％的氨。染色用曙红的部分自来水中发展hemalum染色至少10分钟（H＆E）后3分钟。
5. 嵌入在安装介质中的脱水幻灯片，观察光镜下的幻灯片。

5，免疫组化

1. 末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记法（TUNEL）
   1. 孵育20微克/毫升的蛋白酶K的去石蜡切片在室温下搅拌15分钟。用Tris洗部分三次，每次5分钟缓冲盐水（TBS）。
   2. 孵化用50μlTUNEL反应混合物（10％标记溶液和90％的酶溶液）的部分，在湿润室中于37℃进行60分钟。用TBS，每次5分钟洗涤3次。
   3. 安装带安装含有DAPI介质的幻灯片，并观察在荧光显微镜下的滑动。
2. 增殖细胞核抗原（PCNA）染色
   1. 沸腾在抗原修复缓冲液（Tris-EDTA + 0.05％吐温20，pH9.0）中的脱石蜡切片3分钟，洗三次，用TBS，每次5分钟。用100μl封闭溶液（TBS +10％山羊正常血清+1％牛血清白蛋白，pH7.6）中，在室温下搅拌1小时阻断。
   2. 用在1抗PCNA的初级抗体染色1:200稀释，在湿润室中于4℃下过夜。用TBS +吐温20，每次5分钟洗涤3次。
   3. 完成检测与在1相应的二级抗体1:500稀释，在室温下搅拌1小时。
   4. 安装带安装含有DAPI介质的幻灯片，并观察在荧光显微镜下的滑动。

结果

视力:

该实验装置[空间频率:0.042圆/度（C / D）;对比度:100％;漂移速度:20度/秒（D / SRC）;背光亮度:本研究的152 cd /米^2]启用成年斑马鱼OKR评估。 VA测量的平均持续时间大约为5 - 10分钟，每一个斑马鱼，其耐受性的方法好。 MNU曝光前视力为0.577±0.014周/度（C / D）， 图1示出了视觉灵敏度当然150毫克/升的MNU后应用。从第1天开始，将测量结果显示在视敏度有显?...

讨论

此前，本集团已转移光感受器变性的MNU模式从啮齿动物到斑马鱼系统^9。随后的事件进行了描述，并随访了30天。在这段时间内完整视网膜形态退化和再生的初始治疗后发生。首先，组织学显示，从3天减少杆细胞计数与最小的相应8天，TUNEL染色MNU处理后第3天确定的视杆细胞的凋亡。再生开始的INL为3天，最长为5天外核层，增殖细胞可观察到的观察期，最大的结尾处5天，这是与此相反的INL在...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A6283
Ammonia	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	294993	0.80%
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	05470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	45260
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860	100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	E10521	Tricaine
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit Alexa 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11012
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	320331	0.20%
In situ Cell Death Detection Kit	Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland	11684795910	TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution	Merck, Darmstadt, Germany	109249
Methylnitrosourea (MNU)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	N4766	Toxic
OptoMotry	CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada	n.a.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Proteinase K	Dako, Glostrup, Danmark	S3004
Rabbit anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA	sc-33756
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Trizma base	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	T1503
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain	University of Fribourg, Dept. of Biology	n.a.	Own fish facility