Metilnitrosourea (MNU) inducida por la Retina Degeneración y Regeneración en el pez cebra: características histológicas y funcionales

Resumen

Aquí demostramos cuantificación de de retina y la regeneración y su impacto en la función visual usando N-metil-N-nitrosourea en el pez cebra adulto. Pérdida de la agudeza visual y la disminución de los números de fotorreceptores fueron seguidos por la proliferación en la capa nuclear interna. Regeneración morfológica y funcional completa ocurrió 30 días después del tratamiento inicial.

Resumen

Enfermedades retinianas degenerativas, por ejemplo, la retinitis pigmentosa, con daño resultante cuenta fotorreceptor para la mayoría de pérdida de la visión en el mundo industrial. Los modelos animales son de importancia fundamental para estudiar este tipo de enfermedades. En este sentido la toxina-fotorreceptor específico N-metil-N-nitrosourea (MNU) ha sido ampliamente utilizado en roedores para inducir farmacológicamente degeneración de la retina. Anteriormente, hemos establecido un modelo de degeneración de la retina inducida por MNU en el pez cebra, otro modelo de sistema popular en la investigación visual.

A diferencia fascinante para los mamíferos es la neurogénesis persistente en la retina del pez cebra adulto y su regeneración después del daño. Para cuantificar esta observación hemos empleado mediciones de agudeza visual en el pez cebra adulto. De este modo, se utilizó el reflejo optocinético para seguir los cambios funcionales en los peces no anestesiado. Esto se complementó con la histología, así como staini inmunohistoquímicang para la apoptosis (TUNEL) y proliferación (PCNA) para correlacionar los cambios morfológicos en desarrollo.

En resumen, la apoptosis de los fotorreceptores se produce tres días después de tratamiento MNU, que es seguido por una reducción marcada de las células en la capa nuclear externa (ONL). A partir de entonces, se observa proliferación de células en la capa nuclear interna (INL) y ONL. Aquí, nos revelan que no sólo es un histológica completa sino también una regeneración funcional se produce durante un transcurso de tiempo de 30 días. Ahora nos ilustran los métodos para cuantificar y hacer un seguimiento de retina del pez cebra y la regeneración utilizando MNU en un video-formato.

Introducción

Visión es el sentido más importante para el ser humano y su deterioro tiene un impacto socio-económico alto. En el mundo desarrollado, las enfermedades degenerativas de la retina son la principal causa de pérdida de visión y ceguera entre los adultos mayores ^1. La causa de la mayoría de las enfermedades degenerativas de la retina está sólo parcialmente entendida y soluciones terapéuticas para recuperar la visión perdida son muy limitadas. La retinitis pigmentosa es un ejemplo típico de una enfermedad degenerativa de la retina con la pérdida de fotorreceptores primaria ^2-3. N-metil-N-nitrosourea (MNU) induce la degeneración de la retina y por lo tanto es ampliamente utilizado en roedores para modelar enfermedades con la muerte de las células fotorreceptoras primaria ^4. Es un agente alquilante y conduce a tumores benignos y malignos, los cuales suelen aparecer varios meses después de la exposición ^5-7. Además, provoca la muerte de las células fotorreceptoras específica dentro de un período de observación a corto plazo. De este modo, la pérdida de la capa retiniana structure y el adelgazamiento de la retina significativa se observó de manera dependiente de la concentración. Células gliales de la retina se activan, pero no se encontraron cambios en el epitelio pigmentario de la retina (EPR). Retículo endoplasmático (ER) la apoptosis relacionada con el estrés parece ser la vía principal de la acción MNU en la retina ^8.

Recientemente hemos introducido MNU como un modelo químico para inducir la degeneración de los fotorreceptores en el pez cebra ^9. Entre otras razones, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en importante en la investigación visual debido a las similitudes de su sistema visual a la de otros vertebrados ^10. La retina externa contiene los fotorreceptores, que se pueden agrupar en cuatro tipos de conos diferentes con sensibilidades de los picos en el ultravioleta, a corto, medio y largo longitud de onda del espectro visible y una barra tipo fotorreceptor. En la capa nuclear interna (INL), los cuerpos celulares de las bipolares, amacrinas y interneuronas horizontales se encuentran, como well como el soma celular de las células gliales de Müller. En la capa plexiforme externa (OPL) se forman los contactos sinápticos entre fotorreceptores y la retina interna, mientras que la capa de células más cerca de la lente es la capa de células ganglionares (GC), que forman los componentes de los axones largos que comprenden el nervio óptico y el tracto óptico . Contactos sinápticos entre las células ganglionares y las células en la capa nuclear interna se forman en la capa plexiforme interna (IPL) ^11. El RPE se encuentra fuera de la retina neurosensorial y rodea los segmentos externos de los fotorreceptores con microvellosidades apicales de largo ^12. Por otra parte, el pez cebra es altamente regenerativo y capaz de regenerar el cerebro lesioned, retina, médula espinal, el corazón y otros tejidos ^13. Cuando se produce daño en la retina, las células en la INL, que se cree que son las células de Müller, se activan y tienen el potencial de diferenciarse en diversos tipos de células de la retina. Además, también generan progenitores de varilla, que se encuentran en el ONL. Otro modource que suministra la retina del pez cebra adulto con nuevas células es la zona marginal ciliar. Esta fuente es necesaria para lograr una densidad constante de fotorreceptores de los bastones en el ojo de pez cebra en continuo crecimiento ^14.

El modelo MNU se puede utilizar como un enfoque sencillo y reproducible degeneración / regeneración de tejido de la retina. Debido a ciertas similitudes de los procesos biológicos en el pez cebra y en los seres humanos esto podría abrir las puertas para identificar vías de muerte celular implicados y para detectar potenciales medicamentos neuroprotectores. Basado en un estudio previo de nuestro grupo, que ahora ilustran los métodos de este modelo de pez cebra inducido por MNU de de retina y la consiguiente regeneración incluyendo cambios funcionales con acuerdo vídeos laboratorio ^9.

Protocolo

Todos los experimentos se adhirieron a la Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Visión de Investigación de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO).

1. Animales

1. Mantener el pez cebra de tipo salvaje (Danio rerio) de la cepa AB (Oregon) con edades comprendidas entre 6 a 12 meses en condiciones normales en el agua con una temperatura de 26,5 ° C y un 14/10 horas de luz / oscuridad ciclo ^15.
2. Siga las instrucciones de cuidado de los animales de las instituciones involucradas para los experimentos con animales después de la aprobación por la Oficina Veterinaria Cantonal.

2. Tratamiento MNU

1. Preparar agua que contiene 150 mg / L de sustancia seca de N-metil-N-nitrosourea (MNU). PRECAUCIÓN! MNU es tóxico; puede provocar cáncer, alteraciones genéticas hereditarias o daño al niño no nacido.
2. Incubar pez cebra en el agua que contiene el MNU durante 60 min a temperatura ambiente.
3. Enjuagar rápidamente con el pez cebraagua dulce y puso el pescado a un nuevo tanque de peces sin MNU. Mantener el pescado en condiciones estándar tanto como se desee para los experimentos.

3. Visual Acuity Medición

1. Inicie el sistema optomotor, elija 'prueba' en el menú y configurar las opciones para "Simple escalera", "Agudeza (Freq)" y "Aleatorio / independiente" ^16.
2. Instale una botella de infusión llena con 500 ml de agua aproximadamente 1 m por encima del sistema optomotor.
3. Coloque un pez cebra en la cámara de exploración y conectarlo a la botella de infusión. Coloque la cámara de examen en el sistema optomotor.
4. Inicie la medición y observar el movimiento del ojo en tiempo real en la pantalla del ordenador. De esta manera, una respuesta positiva ("sí") se define como movimientos sacádicos consecutivos en la dirección correcta, mientras que una respuesta negativa ("no") representa los movimientos oculares aleatorios similares a los observados con la estaciónrejillas arias. Si los ojos de la exposición pez cebra tres o más respuestas optocinético posteriores (OKR), pulse "sí"; si no es así, pulse 'no'.
5. Extraer la agudeza visual, que ha sido calculada por el software mediante la determinación del umbral de la frecuencia espacial del estímulo optocinético, en "Resultados" en el menú.

4. Histología

1. La eutanasia el pez cebra por una sobredosis de acetato de metanosulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (200-300 mg / L) y enucleación de los ojos.
2. Fije el conjunto de ojos en el 4% de paraformaldehído (PFA) en tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C durante 12 horas y luego deshidratar las muestras en una serie gradual de alcohol.
3. Insertar las muestras en parafina, se cortaron secciones de 5 micras a través de la cabeza del nervio óptico (ONH) y montarlos en un portaobjetos de vidrio.
4. Teñir las secciones de parafina deparaffized con hemalum durante 4 minutos y sumergir los portaobjetos dos veces en agua destilada seguido de aci clorhídrico 0,2%d y 0,8% de amoníaco. Teñir las secciones con eosina durante 3 minutos después del desarrollo de la tinción hemalum en agua corriente durante al menos 10 min (H & E).
5. Insertar las diapositivas deshidratados en medio de montaje y observar las diapositivas bajo el microscopio óptico.

5. inmunohistoquímica

1. Desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL)
   1. Incubar las secciones desparafinadas con 20 mg / ml de proteinasa K a temperatura ambiente durante 15 min. Lávese las secciones tres veces con Tris salino (TBS) tamponada durante 5 minutos cada uno.
   2. Incubar las secciones con 50 l mezcla de reacción TUNEL (solución de etiquetado 10% y solución de enzima 90%) en una cámara humidificada a 37 ° C durante 60 min. Lavar tres veces con TBS durante 5 minutos cada uno.
   3. Monte los portaobjetos con medio que contiene DAPI montaje y observar las diapositivas bajo el microscopio de fluorescencia.
2. La proliferación celular antígeno nuclear (PCNA) tinción
   1. Hervir los cortes desparafinados en tampón de recuperación de antígeno (Tris-EDTA + 0,05% de Tween 20, pH 9,0) durante 3 min y se lava tres veces con TBS durante 5 min cada uno. Bloquear con 100 l solución de bloqueo (TBS + 10% de suero normal de cabra + 1% de albúmina de suero bovino, pH 7,6) a temperatura ambiente durante 1 hr.
   2. Teñir con anti-PCNA anticuerpos primarios en una dilución 1: 200 en una cámara húmeda a 4 ° C durante la noche. Lavar tres veces con TBS + Tween 20 durante 5 minutos cada uno.
   3. Terminar la detección con los anticuerpos secundarios apropiados, en una dilución de 1: 500 a temperatura ambiente durante 1 hr.
   4. Monte los portaobjetos con medio que contiene DAPI montaje y observar las diapositivas bajo el microscopio de fluorescencia.

Resultados

Agudeza visual:

El montaje experimental [frecuencia espacial: 0.042 círculos / grado (c / d); Contraste: 100%; velocidad de deriva: 20 grados / segundo (d / src); volver luminancia luz: 152 cd / m ^2] de este estudio permitió evaluar OKR de adultos de pez cebra. La duración media de la medición VA fue de unos 5 a 10 minutos para cada pez cebra, que toleró bien el procedimiento. La agudeza visual antes de la exposición MNU fue 0.577 ± 0.014 ciclos / grado (c / d). Fig...

Discusión

Anteriormente, nuestro grupo ha transferido el modelo MNU de degeneración de los fotorreceptores de los roedores en el sistema de pez cebra ^9. Los acontecimientos que siguieron fueron descritos y seguidos durante un máximo de 30 días. En este período de tiempo completa degeneración de la retina y la regeneración morfológica se produjeron después del tratamiento inicial. En primer lugar, la histología revela un recuento celular reducido de varilla de 3 días con un mínimo en día 8. Correspondienteme...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A6283
Ammonia	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	294993	0.80%
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	05470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	45260
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860	100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	E10521	Tricaine
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit Alexa 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11012
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	320331	0.20%
In situ Cell Death Detection Kit	Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland	11684795910	TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution	Merck, Darmstadt, Germany	109249
Methylnitrosourea (MNU)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	N4766	Toxic
OptoMotry	CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada	n.a.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Proteinase K	Dako, Glostrup, Danmark	S3004
Rabbit anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA	sc-33756
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Trizma base	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	T1503
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain	University of Fribourg, Dept. of Biology	n.a.	Own fish facility