조직 학적 및 기능적 특성 : Methylnitrosourea (MNU)는 망막 변성과 재생 제브라 피쉬에서 유도 된

요약

여기에서 우리는 망막 있도록 지연 및 재생과 성인 제브라 피쉬에서 N 메틸 N의 -nitrosourea을 사용하여 시각 기능에 미치는 영향의 정량화를 보여줍니다. 시력의 손실 및 감소 감광체 번호는 내부 핵 층에 확산하여 관찰 하였다. 완전한 형태 학적 및 기능적 재생은 30 일 초기 치료 후 발생했습니다.

초록

산업계에서 시력 손실의 대부분 감광체 손상 계정 얻어진 망막 퇴행성 질환, 예를 들면 색소 성 망막염,. 동물 모델은 질병을 연구하는 중요한 중요하다. 이 점에있어서의 N - 메틸 - N -nitrosourea (MNU)가 설치류에서 널리 사용되어왔다 감광체 특정 독소는 약리 망막 변성을 유도한다. 이전에, 우리는 제브라 피쉬의 MNU에 의한 망막 변성 모델, 시각 연구에서 또 다른 인기 모델 시스템을 설립했다.

포유 동물 매혹적인 차이는 성인 zebrafish의 망막 손상 후의 재생의 지속적인 신경이다. 우리는 성인 zebrafish의 시력 측정을 채용 한이 관찰을 정량화합니다. 이로써, optokinetic 휘어진 비 마취 물고기 기능적 변화를 수행하는 데 사용되었다. 이것은 면역 staini뿐만 아니라 조직 학적으로 보충 하였다세포 사멸에 대한 NG (TUNEL) 및 확산 (PCNA)의 개발 형태 학적 변화의 상관 관계를합니다.

요약하면, 광 수용체 세포 자멸 사흘 외부 핵 층 (ONL)에서 세포의 현저한 감소로 이어진다 MNU 치료 후 발생한다. 그 후, 내부 핵 층 (INL)와 ONL에서 세포의 증식이 관찰된다. 여기서, 우리는 완전한 조직 학적뿐만 아니라 또한 재생 기능 30 일의 시간을 걸쳐 발생하는 것을 알 수있다. 이제 우리는 정량화 및 비디오 형식으로 MNU를 사용하여 제브라 피쉬의 망막 있도록 지연 및 재생을 수행하는 방법을 설명한다.

서문

비전은 인간의 가장 중요한 감각과 손상은 높은 사회 경제적 영향을 미친다. 선진국에서는 망막 퇴행성 질환은 노인 ¹ 중 시력 손실과 실명의 주요 원인이다. 대부분의 퇴행성 망막 질환의 원인은 부분적으로 만 이해하고 치료 적 솔루션은 잃어버린 시력을 회복하는 것은 매우 제한되어 있습니다. 색소 성 망막염이 N의 -nitrosourea (MNU) 망막 변성을 유도를 메틸 차 감광체 손실 ^2-3. N과 망막 퇴행성 질환의 전형적인 예이고 따라서 광범위 일차 시각 세포 사멸 ⁴ 질환을 모델링 설치류에서 사용된다. 그것은 알킬화제이며 일반적으로 노출 ^5-7 후 몇 개월을 나타 양성과 악성 종양으로 이어집니다. 또한, 단기간의 관찰 기간 내에 특정 시각 세포 사멸시킨다. 이로써, 망막 층 structu의 손실다시 상당한 망막 박화는 농도 의존적​​ 방식으로 관찰되었다. 망막 글 리아 세포는 활성화되었지만, 망막 색소 상피 세포 (RPE)의 변경이 발견되지 않음. 소포체 (ER) 스트레스와 관련된 세포 사멸은 망막 ⁸ MNU 조치의 주요 통로가 될 것으로 보인다.

우리는 최근에 제브라 피쉬 ^구에서 광 수용체의 변성을 유도하는 화학 모델로 MNU를 도입했습니다. 다른 이유의 사이에, 제브라 피쉬 (다니오 rerio)가 있기 때문에 다른 척추 동물 ^(10)의 그것의 시각 시스템의 유사성 시각 연구에 중요 해지고있다. 외부 망막은 자외선, 짧은, 중간에 피크 감도, 가시 스펙트럼의 장파장 한로드 광 수용체의 유형 네 가지 콘 유형으로 분류 될 수있는 광 수용체를 포함하고 있습니다. 내부 핵 계층 (INL)에서, 바이폴라, 수평 및 무 축삭의 interneurons의 세포 기관은 아 같이 발견뮐러 글 리아 세포의 세포 소마 같은 리터. 외측 얼기 층 (OPL)에서 감광체와 내측 망막 사이의 연접은 렌즈에 가장 가까운 세포층 반면 시신경 및 시신경 요로로 이루어지는 긴 축삭을 형성 성분 신경절 세포 층 (GC)이다 형성된 . 신경절 세포 및 내부 핵 층에있는 세포 간의 연접은 내측 얼기 층 (IPL) ^(11)에 형성된다. RPE는 감각 신경 망막의 외측에있는 긴 혀끝의 미세 융모 ⁽¹²⁾ 감광체 외부 세그먼트를 둘러싼 다. 또한, 제브라 피쉬는 매우 회생 및 병변 뇌, 망막, 척수, 심장, 및 기타 조직 ^(13)를 다시 자라게 할 수 있습니다. 망막 손상이 발생하면, 뮐러 세포 것으로 생각된다 INL에서 세포 활성화 및 각종 망막 세포 유형으로 분화 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 또한, 그들은 또한 ONL에있는로드 전구 세포를 생성한다. 또 이렇게새로운 세포로 성인 제브라 피쉬의 망막을 공급, 나아가이 섬모 한계 영역입니다. 이 소스는 연속적으로 성장하는 피쉬 아이 ^{(14)에로드} 감광체의 일정한 밀도를 달성하기 위해 필요하다.

MNU 모델은 망막 조직에 대한 단순하고 재현성 퇴화 / 재생 방법으로 사용될 수있다. 때문에 제브라 피쉬의 생물학적 과정의 특정 유사성과 인간이 관여 세포 사멸 경로를 확인하기 위해 문을 열 수있는 잠재적 신경 보호 약물을 선별. 우리 그룹에서 이전의 연구를 바탕으로, 우리는 지금 망막 있도록 지연 및 실험실 동영상 ^{구에 따라} 기능적인 변화를 포함 필연적 재생이 MNU 유도 제브라 피쉬 모델의 방법을 설명한다.

프로토콜

모든 실험은 안과 및 비전 연구 협회의 비전 연구 및 안과 (ARVO)에서 동물의 사용에 대한 정책을 준수.

1 동물

1. 26.5 ° C의 온도 및 14/10 시간의 명 / 암주기를 ¹⁵ 물에 표준 조건 하에서 6~12개월 세 사이의 AB (오레곤) 균주의 야생형 제브라 피쉬 (다니오 rerio)를 유지한다.
2. 분할 한 동물 병원의 승인 후 동물 실험에 대한 관련 기관의 동물 관리 가이드 라인을 따르십시오.

2 MNU 처리

1. N 메틸 N의 -nitrosourea (MNU)의 150 ㎎ / ℓ 건조 물질을 함유 물을 준비합니다. 주의! MNU는 독성; 태아에 암, 유전 적 손상이나 상해가 발생할 수 있습니다.
2. 실온에서 60 분 동안 MNU를 함유하는 물에서 배양 지브라 피쉬.
3. 빨리와 제브라 피쉬를 씻어신선한 물과는 MNU 않고 새 수조에 물고기를 넣어. 실험을 위해 원하는만큼 표준 조건에서 물고기를 유지한다.

3 시력 측정

1. , optomotor 체제를 시작 메뉴에서 '테스트'를 선택하고 옵션을 설정 "단순 계단", "시력 (주파수)"과 "무작위 / ^{분리"(16)이다.}
2. optomotor 시스템 위 1m에 대해 500 ml의 물을 가득 주입 병을 설치합니다.
3. 시험 챔버에서 한 제브라 피쉬를 놓고 주입 병에 연결합니다. optomotor 시스템의 시험 챔버를 놓습니다.
4. 측정을 시작하고, 컴퓨터 화면에 실시간으로 안구의 움직임을 관찰한다. 따라서, 긍정적 인 응답이 ( "예") 부정 응답 ( "아니오") 반면, 올바른 방향으로 연속 안구 단속 운동으로 정의된다 역으로 관찰하는 사람과 유사한 임의 눈동자의 움직임을 나타냅니다진 격자. 제브라 피쉬 전시의 눈 경우 세 이상의 후속 optokinetic 응답 (OKR), '예'버튼을 누르면; 그렇지 않은 경우, Enter 키를 누르면 '없음'.
5. 메뉴의 "결과"에, optokinetic 자극의 공간 주파수의 임계 값을 결정하여 소프트웨어에 의해 계산 된 시력을 추출합니다.

4 조직학

1. 에틸 3 - 아미노 벤조 에이트 메탄 (200 ~ 300 ㎎ / ℓ)의 과다 복용으로 제브라 피쉬를 안락사와 눈을 명백히하다.
2. 등급 알코올 시리즈에서 샘플을 탈수 한 후 12 시간 동안 4 ° C에서 인산염 완충 생리 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (PBS)에 전체의 눈을 고정합니다.
3. 파라핀에 샘플을 포함, 시신경 유두 (시신경 유두)를 통해 5 μm의 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 그들을 탑재합니다.
4. 4 분간 hemalum와 deparaffized 파라핀 섹션 얼룩과 0.2 % 염산 ACI이어서 증류수 슬라이드 두 번 찍어D와 0.8 % 암모니아. 적어도 10 분 (H & E)에 대한 수돗물 hemalum 염색 현상 후 3 분 동안 에오신 섹션 얼룩.
5. 매질에 부착 탈수 슬라이드를 포함하고 광학 현미경 슬라이드를 관찰한다.

(5) 면역 조직 화학

1. 터미널 deoxynucleotidyl 전이 된 dUTP 닉 엔드 라벨링 (TUNEL)
   1. 실온에서 15 분간 20 μg / ㎖ 프로 테이나 제 K와 탈 파라핀 섹션 부화. 트리스 절을 세 번 씻어 5 분마다 식염수 (TBS)을 버퍼.
   2. 60 분 동안 37 ° C에서 가습 챔버 내에서 50 μL TUNEL 반응 액 (10 % 라벨링 용액 및 90 %의 효소 용액)와 섹션을 부화. 5 분마다 TBS로 3 회 세척 할 것.
   3. DAPI를 포함하는 매체를 장착와 슬라이드 마운트 형광 현미경 슬라이드를 관찰한다.
2. 증식 세포 핵 항원 (PCNA) 염색
   1. 3 분 동안 항원 검색 버퍼 (트리스-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) + 0.05 % 트윈 20, 산도 9.0)에서 탈 파라핀 섹션을 삶아 5 분마다 TBS로 3 회 씻는다. 100 μl를 1 시간 동안 실온에서 용액을 (TBS + 10 % 염소 정상 혈청 + 1 % 소 혈청 알부민, pH7.6)로 블로킹 막기.
   2. 4 ° C에서 하룻밤 가습 챔버에서 200 희석 : 1 항 PCNA 차 항체와 얼룩. 5 분마다 TBS + 트윈 20으로 3 회 반복한다.
   3. 실온에서 1 시간 동안 500 희석 : 1 차 항체와 함께 해당 검출 마무리.
   4. DAPI를 포함하는 매체를 장착와 슬라이드 마운트 형광 현미경 슬라이드를 관찰한다.

결과

시력 :

실험 장치 [공간 주파수 : 0.042 원 /도 (C ​​/ D); 대비 : 100 %; 드리프트 속도 : 20도 / 초 (D / SRC); 백라이트 휘도 : 152 CD / m ^2] 본 연구는 성인 제브라 피쉬의 OKR 평가 수 있었다. 물론 절차를 용인 각 제브라 피쉬, 10 분 - VA 측정의 평균 지속 기간은 약 5였다. MNU 노출 전 시력은 0.577 ± 0.014 사이클 /도 (c / d를)이었다. 1가 150 ㎎ / ℓ MNU의 적용 후 시력 과정...

토론

이전에, 우리 그룹은 제브라 피쉬의 시스템 ^구에 설치류에서 시세포 변성의 MNU 모델을 전송하고있다. 계속되는 이벤트 설명 및 최대 30 일 동안 추적 관찰 하였다. 이 기간에 완전한 형태의 망막 변성 및 재생이 초기 치료 후 발생. 첫째, 조직 학적가 감소 된로드 셀 상응 일 8에서 최소에 일 3에서 계산 계시, TUNEL 염색 삼일 MNU 처리 후로드 광 수용체의 세포 사멸을 식별합니다. 재생은 증식 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A6283
Ammonia	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	294993	0.80%
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	05470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	45260
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860	100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	E10521	Tricaine
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit Alexa 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11012
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	320331	0.20%
In situ Cell Death Detection Kit	Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland	11684795910	TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution	Merck, Darmstadt, Germany	109249
Methylnitrosourea (MNU)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	N4766	Toxic
OptoMotry	CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada	n.a.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Proteinase K	Dako, Glostrup, Danmark	S3004
Rabbit anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA	sc-33756
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Trizma base	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	T1503
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain	University of Fribourg, Dept. of Biology	n.a.	Own fish facility