Histolojik ve Fonksiyonel Özellikleri: Methylnitrosourea (MNU) Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyon Zebra balığı -kaynaklı

Özet

Bu yazıda retina de- ve rejenerasyon ve yetişkin zebrabalıkları N-metil-N -nitrosourea kullanarak görme fonksiyonu üzerindeki etkisinin ölçümü göstermektedir. Görme keskinliği kaybı ve azalmış fotoreseptör numaraları iç nükleer tabakada çoğalması ile takip edildi. Komple morfolojik ve fonksiyonel rejenerasyon 30 gün ilk tedaviden sonra meydana geldi.

Özet

Endüstriyel dünyada görme kaybının çoğunluğu için fotoreseptör hasar hesabı ile sonuçlanan retina dejeneratif hastalıklar, örneğin retinitis pigmentosa,. Hayvan modelleri, bu tür hastalıkları incelemek için temel bir öneme sahiptir. Bu bağlamda, N-metil-N -nitrosourea (ÇUB) yaygın olarak kemirgenlerde kullanılmıştır fotoreseptör spesifik toksin farmasötik olarak retina dejenerasyonuna tetiklemek için karıştırılabilir. Daha önce, Zebra balığı bir MNU kaynaklı retina dejenerasyonu modeli, görsel araştırmalar başka popüler model sistem kurduk.

Memelilere büyüleyici bir fark yetişkin zebrabalıkları retina ve hasar sonra rejenerasyon kalıcı nöron olduğunu. Biz yetişkin zebrabalıkları görme keskinliği ölçümleri istihdam var bu gözlemi ölçmek için. Böylece, optokinetik refleks olmayan anestezi balık fonksiyonel değişiklikleri izlemek için kullanılmıştır. Bu immünhistokimyasal staini yanı sıra histoloji ile takviye edildiapoptosis için ng (TÜNEL) ve çoğalması (PCNA) gelişmekte morfolojik değişiklikler ilişkilendirmek için.

Özet olarak, fotoreseptör apoptoz üç gün dış çekirdek katmanında (ONL) hücrelerin belirgin bir azalma izler ÇUB tedaviden sonra ortaya çıkar. Bundan sonra, iç nükleer tabaka (INL) ve onl hücre çoğalması gözlenmiştir. Burada, bir tam histolojik kalmaz, aynı zamanda etkin bir yenilenmesi, 30 günlük bir süre boyunca oluşturduğunu ortaya koymuştur. Şimdi ölçmek ve video formatında MNU kullanarak Zebra balığı retina DE- ve yenilenmesini takip yöntemleri açıklamaktadır.

Giriş

Vizyon insan için en önemli duyu ve değer düşüklüğü, yüksek sosyo-ekonomik etkisi vardır. Gelişmiş dünyada, retina dejeneratif hastalıklar yaşlı yetişkinler ¹ arasında görme kaybı ve körlük önde gelen nedenidir. En dejeneratif retina hastalıklarının nedeni kısmen anlaşılır ve tedavi çözümleri kayıp vizyon kazanmak için çok sınırlı. Retinitis pigmentosa N -nitrosourea (ÇUB), retinal dejenerasyon meydana metiltio, primer fotoreseptör kaybı ^2-3. N retinal dejeneratif bir hastalığın tipik bir örneğidir ve bu nedenle yaygın primer fotoreseptör hücre ölümü ile ⁴ hastalıkların modellemek için kemirgenlerde kullanılır. Bu bir alkilleyici madde ve genellikle ^5-7 maruz bir kaç ay sonra görünür huylu ve kötü huylu tümörler, yol açar. Buna ek olarak, kısa süreli bir gözlem süresi içinde özel bir fotoreseptör hücre ölümüne neden olur. Böylece, retina tabaka Yapıdaki kaybıre ve anlamlı bir retina incelmesi konsantrasyona bağlı bir şekilde tespit edilmiştir. Retina glia hücreleri aktive edildi, ancak retina pigment epiteli (RPE) hiçbir değişiklik bulundu. Endoplazmik retikulum (ER), stres ile ilgili apoptoz retinada ⁸ ÇUB etkisinin en temel bir yol olarak görünmektedir.

Biz son zamanlarda Zebrafish ⁹ fotoreseptör dejenerasyonu ikna etmek için bir kimyasal model olarak MNU girmiştik. Diğer nedenler arasında, Zebra balığı (Br.rerio) çünkü diğer omurgalıların ¹⁰ o kendi görsel sistemin benzerlikler görsel araştırma önemli hale gelmiştir. Dış retina ultraviyole, kısa, orta tepe hassasiyetleri ve görünür spektrumu uzun dalga boyu ve bir çubuk fotoreseptör türüyle dört farklı koni gruba ayrılabilir olabilir fotoreseptörleri içerir. Iç nükleer tabaka (INL) olarak, bipolar, yatay ve amacrine internöron hücre gövdeleri, wel olarak bulunurlarMuller, glia hücreleri, hücre soma olarak L.. Dış pleksiform katman (OPL) içinde fotoreseptör ve iç retina arasındaki sinaptik iletişim lensin en yakın hücre tabakası ise optik sinir ve optik sistemini içeren uzun aksonlar oluşturan bileşenler ve ganglion hücre tabakası (GC) olan oluşturulmaktadır . Salgı bezleri ve iç nükleer tabakadaki hücrelerin arasında olduğu, sinaptik temasların olarak iç pleksiform tabakasındaki (IPL) ¹¹ oluşur. RPE nörosensöriyel retina dışında yer alır ve uzun apikal mikrovilluslu ¹² ile fotoreseptör dış segmentleri çevreler. Ayrıca, Zebrafish yüksek rejeneratif ve lezyonlu beyin, retina, omurilik, kalp ve diğer dokuları ¹³ yetiştirmeleri için yapabiliyor. Retinal hasar oluştuğunda, Muller hücreleri olduğu düşünülmektedir INL hücreleri, aktive edilmiş ve çeşitli retinal hücre tipleri içine ayırt etmek için bir potansiyele sahiptir. Buna ek olarak, aynı zamanda ONL bulunan çubuk progenitörlerle üretir. Başka bir nedenleYeni hücreler ile yetişkin zebrafish retina malzemeleri urce siliyer marjinal bölgesidir. Bu kaynak, sürekli olarak büyüyen Zebrafish göz ¹⁴ çubuk fotoreseptör sabit bir yoğunluğu elde etmek için gereklidir.

ÇUB modeli retina dokusu için basit ve tekrarlanabilir bir dejenerasyon / yenilenmesi yaklaşımı olarak da kullanılabilir. Nedeniyle Zebra balığı biyolojik süreçler bazı benzerlikleri ve insanlarda bu ilgili hücre ölümü yolları belirlemek için kapıları açmak ve potansiyel nöroprotektif ilaç ekrana. Bizim gruptan bir önceki çalışmaya göre, biz şimdi retina de- ve laboratuvar videoları ⁹ uygun fonksiyonel değişiklikler dahil olmak üzere izleyen rejenerasyon bu MNU kaynaklı zebrabalıkları modelinin yöntemlerini göstermektedir.

Protokol

Bütün deneyler Oftalmik ve Vizyon Araştırma Derneği Vizyon Araştırma ve Oftalmoloji (ARVO) Hayvanların Kullanım Bildirimi yapıştırılır.

1. Hayvanlar

1. 26.5 ° C'lik bir sıcaklıkta ve 14/10 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde ^15, su içinde standart koşullar altında, 6-12 ay arasında değişen AB (Oregon) soyunun, vahşi tip zebrafish (Br.rerio) koruyun.
2. Kanton Veteriner Dairesi tarafından onaylandıktan sonra hayvan deneyleri için ilgili kurumların hayvan bakım yönergeleri izleyin.

2. MNU Tedavi

1. N-metil-N -nitrosourea (ÇUB) 150 mg / L kuru madde ihtiva eden su hazırlayın. DİKKAT! ÇUB toksiktir; Doğmamış çocuğa kanser, kalıtsal genetik hasara veya zarar görmesine neden olabilir.
2. , Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca MNU ihtiva eden su içinde zebrafish inkübe edin.
3. Hızlı bir şekilde Zebra balığı durulayıntatlı su ve MNU olmadan yeni bir balık tankına balık koymak. Deneyler için arzu edildiği sürece, standart koşullar altında balık koruyun.

3. Görme Keskinliği Ölçümü

1. , Optomotor sistemini başlatmak menüden 'test' seçin ve seçenekleri ayarlayın "Basit Staircase", "Keskinliği (Frekans)" ve "Tesadüf / Ayrı" ^16.
2. Optomotor sistemi üzerinde 1 m ile yaklaşık 500 ml su ile doldurulmuş bir infüzyon şişesi takın.
3. Sınav odasında bir Zebra balığı yerleştirin ve infüzyon şişesi bağlayın. Optomotor sistemde muayene odasına yerleştirin.
4. Ölçümü başlatın ve bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak göz hareketi gözlemlemek. Böylece, olumlu bir yanıt ("evet") olumsuz yanıt ("hayır") ise, doğru yönde ardışık sakkadlardan olarak tanımlanır istasyonu ile gözlenen benzeyen rastgele göz hareketleri temsilary ızgaralar. Zebra balığı sergi gözünde ise üç veya daha fazla sonraki optokinetik tepkiler (OKR), basın 'evet'; değilse, basın 'hayır'.
5. Menüsünden "Sonuçlar" başlığı altında, optokinetik uyaranın uzaysal frekansa eşik belirleyerek yazılım tarafından hesaplanmıştır görme keskinliği, ayıklayın.

4. Histoloji

1. Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (200-300 mg / L) bir doz aşımı zebrafish Euthanize ve gözleri enükleasyonu.
2. Bir kademeli alkol serisi içinde dehidre örnekleri daha sonra 12 saat boyunca 4 ° C'de fosfat tamponlu tuz içerisinde% 4 paraformaldehit (PFA) (PBS) içinde bütün gözleri saptamak ve.
3. Parafinde örnekleri embed optik sinir başı (OSB) ile 5 mikron bölümleri kesip bir cam slaytlar monte ederek.
4. 4 dakika boyunca hemalum ile deparaffized parafin kesitleri Leke ve% 0.2 hidroklorik ACI, ardından damıtılmış su içinde slaytlar iki kez daldırmad ve% 0.8 amonyak. En az 10 dakika (H & E) musluk suyu hemalum boyamanın geliştirilmesi sonra 3 dakika boyunca eosin ile bölümleri Leke.
5. Orta montaj susuz slaytlar embed ve ışık mikroskobu altında slaytlar gözlemlemek.

5. İmmünhistokimya

1. Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç etiketleme (TÜNEL)
   1. 15 dakika boyunca, oda sıcaklığında 20 ug / ml proteinaz K ile inkübe bölümleri deparafınize edildi. Tris ile bölümlerinin üç kez yıkayın 5 dakika her biri için tuzlu su (TBS) tamponlu.
   2. 60 dakika boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş bir haznede 50 ul TÜNEL tepkime karışımıyla (% 10 etiketleme çözeltisi ve% 90 enzim solüsyonu) ile inkübe bölümleri. 5 dakika her biri için üç kez TBS ile yıkayın.
   3. DAPI içeren yerleştirme ortamı ile slaytlar takın ve flöresanlı mikroskop altında slaytlar izleyin.
2. Prolifere Hücre Nükleer Antijen (PCNA) boyama
   1. 3 dakika boyunca antijen geri alma tamponu (Tris-EDTA +% 0.05 Tween 20, pH 9.0) içinde deparafinize edilmiş kesitlerin kaynatılır ve 5 dakika her biri için üç kez TBS ile yıkayın. 100 ul, 1 saat boyunca oda sıcaklığında çözeltisi (TBS +% 10 normal keçi serumu +% 1 sığır serum albümini, pH 7.6) ile bloke ile bloklayın.
   2. Gece boyunca 4 ° C'de nemlendirilmiş bir haznede 200 seyreltme: 1 anti-PCNA primer antikorlar ile Leke. 5 dakika her biri için TBS + Tween 20 ile üç kez yıkayın.
   3. 1 saat boyunca oda sıcaklığında 500 seyreltme: 1 uygun sekonder antikor ile algılamayı bitirin.
   4. DAPI içeren yerleştirme ortamı ile slaytlar takın ve flöresanlı mikroskop altında slaytlar izleyin.

Sonuçlar

Görme keskinliği:

Deneysel set-up [mekansal frekans: 0.042 daireler / derecesi (c / d); kontrast: 100%; sürüklenme hızı: 20 derece / saniye (d / src); arka ışık parlaklık: 152 cd / m ^2] Bu çalışmada, yetişkin zebrabalıkları OKR değerlendirmesini sağladı. Iyi prosedürü tolere her zebrabalıkları, 10 dakika - VA ölçüm süresi ortalama yaklaşık 5 oldu. MNU maruz önce görme keskinliği 0.577 ± 0.014 devir / derece (c / d) idi. 1 150 mg / ...

Tartışmalar

Daha önce, bizim grup Zebrafish sistemine ⁹ içine kemirgenler fotoreseptör dejenerasyonu MNU modelini transfer etti. Takip eden olaylar anlatılmış ve 30 güne kadar takip edildi. Bu süre içinde tam retina morfolojik dejenerasyon ve rejenerasyon ilk tedaviden sonra meydana geldi. İlk olarak, histoloji azalmış bir çubuk hücre Buna 8. günde en az on gün 3 saymak ortaya, TUNEL boyama 3 gün MNU tedaviden sonra çubuk fotoreseptör apoptozisini tanımlar. Rejenerasyon Prolifere eden hücreler, bu ç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A6283
Ammonia	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	294993	0.80%
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	05470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	45260
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860	100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	E10521	Tricaine
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit Alexa 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11012
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	320331	0.20%
In situ Cell Death Detection Kit	Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland	11684795910	TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution	Merck, Darmstadt, Germany	109249
Methylnitrosourea (MNU)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	N4766	Toxic
OptoMotry	CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada	n.a.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Proteinase K	Dako, Glostrup, Danmark	S3004
Rabbit anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA	sc-33756
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Trizma base	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	T1503
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain	University of Fribourg, Dept. of Biology	n.a.	Own fish facility