Methylnitrosourea (MNU) indotta retinica degenerazione e rigenerazione in Zebrafish: istologica e Caratteristiche Funzionali

Riepilogo

Qui dimostriamo quantificazione dei de- retina e la rigenerazione e il suo impatto sulla funzione visiva con N -methyl- N -nitrosourea in zebrafish adulto. Perdita di acuità visiva e diminuito il numero dei fotorecettori sono state seguite dalla proliferazione nello strato nucleare interno. Completa rigenerazione morfologica e funzionale si è verificato 30 giorni dopo il trattamento iniziale.

Abstract

Malattie degenerative della retina, ad esempio, retinite pigmentosa, con conseguente danno conto fotorecettore per la maggior parte della perdita della vista nel mondo industriale. I modelli animali sono di fondamentale importanza per lo studio di tali malattie. A questo proposito la tossina specifica-fotorecettore N -methyl- N -nitrosourea (MNU) è stato ampiamente utilizzato nei roditori per indurre farmacologicamente degenerazione retinica. In precedenza, abbiamo stabilito un modello di degenerazione retinica MNU indotta in zebrafish, un altro sistema modello popolare in ricerca visiva.

Una differenza affascinante per i mammiferi è la neurogenesi persistente nell'adulto retina zebrafish e la loro rigenerazione dopo un danno. Per quantificare questa osservazione abbiamo impiegato le misure di acuità visiva in zebrafish adulto. In tal modo, il riflesso optocinetica è stata utilizzata per seguire i cambiamenti funzionali nei pesci non anestetizzato. Questo è stato integrato con istologia e immunoistochimica staining per apoptosi (TUNEL) e la proliferazione (PCNA) di correlare i cambiamenti morfologici in via di sviluppo.

In sintesi, l'apoptosi dei fotorecettori avviene tre giorni dopo il trattamento MNU, che è seguita da una marcata riduzione delle cellule nello strato nucleare esterno (ONL). Successivamente, la proliferazione delle cellule nello strato nucleare interno (INL) e ONL si osserva. Qui, ci rivelano che non solo istologica completa, ma anche una rigenerazione funzionale si verifica nel corso di un corso di 30 giorni. Ora si illustrano i metodi per quantificare e seguire zebrafish de- retina e rigenerazione utilizzando MNU in un video formato.

Introduzione

Vision è il senso più essenziale per l'essere umano e la sua perdita di valore ha un elevato impatto socio-economico. Nel mondo sviluppato, le malattie degenerative della retina sono la principale causa di perdita della vista e cecità tra gli adulti più anziani ^1. La causa della maggior parte delle malattie degenerative della retina è solo parzialmente compreso e soluzioni terapeutiche per recuperare la vista perduta sono molto limitate. La retinite pigmentosa è un tipico esempio di una malattia degenerativa della retina con perdita dei fotorecettori primaria ^2-3. N -methyl- N -nitrosourea (MNU) induce degenerazione retinica e quindi è ampiamente usato nei roditori per modellare malattie con fotorecettori primaria morte cellulare ^4. Si tratta di un agente alchilante e porta a tumori benigni e maligni, che di solito compaiono diversi mesi dopo l'esposizione ^5-7. Inoltre, provoca la morte cellulare dei fotorecettori specifica entro un periodo di osservazione di breve termine. In tal modo, la perdita dello strato structu retinare e significativo assottigliamento della retina sono stati osservati in maniera concentrazione-dipendente. Cellule gliali retiniche sono stati attivati, ma non sono state trovate variazioni nel epitelio pigmentato retinico (RPE). Reticolo endoplasmatico (ER) apoptosi legati allo stress sembra essere la via principale di azione MNU nella retina ^8.

Abbiamo recentemente introdotto MNU come modello chimico per indurre degenerazione dei fotorecettori in zebrafish ^9. Tra le altre ragioni, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato importante nella ricerca visiva a causa della somiglianza del suo sistema visivo a quello di altri vertebrati ^10. La retina esterna contiene i fotorecettori, che possono essere raggruppati in quattro diversi tipi di coni con sensibilità di punta in nell'ultravioletto, a breve, medio e lungo lunghezze d'onda dello spettro visibile e una canna tipo di fotorecettori. Nello strato nucleare interno (INL), i corpi cellulari dei bipolari, orizzontali, amacrine e interneuroni si trovano, come well come il soma cellulare delle cellule gliali Muller. Nello strato plessiforme esterno (OPL) si formano i contatti sinaptici tra fotorecettori e la retina interna, mentre lo strato di cellule più vicino alla lente è lo strato di cellule gangliari (GC), quali componenti formano lunghi assoni che costituiscono il nervo ottico e delle vie ottiche . Contatti sinaptici tra le cellule gangliari e le cellule nello strato nucleare interno si formano nello strato plessiforme interno (IPL) ^11. La RPE si trova al di fuori della retina neurosensoriale e circonda i segmenti esterni dei fotorecettori con lunghi microvilli apicale ^12. Inoltre, il pesce zebra è altamente rigenerativa e in grado di far ricrescere cervello lesionato, retina, midollo spinale, cuore, e di altri tessuti ^13. Quando si verifica un danno retinico, le cellule del INL, che si pensa siano le cellule Müller, sono attivati ​​e hanno il potenziale di differenziarsi in vari tipi di cellule retiniche. Inoltre, essi generano anche progenitori asta, che si trovano nella ONL. Un altro modopubblico Fonte che alimenta la retina di zebrafish adulto con nuove cellule è la zona marginale ciliare. Questa fonte è necessaria per ottenere una densità costante di bastoncelli nel zebrafish continua crescita dell'occhio ^14.

Il modello MNU può essere utilizzato come un approccio semplice e riproducibile degenerazione / rigenerazione di tessuto retinico. A causa di alcune somiglianze di processi biologici in zebrafish e negli esseri umani questo potrebbe aprire le porte ad individuare percorsi di morte cellulare coinvolti e per lo screening potenziali farmaci neuroprotettivi. Sulla base di un precedente studio del nostro gruppo, che ora illustreremo i metodi di questo modello zebrafish MNU indotta di de- retina e conseguente rigenerazione compresi i cambiamenti funzionali con funzione video laboratorio ^9.

Protocollo

Tutti gli esperimenti hanno aderito alla Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research dell'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO).

1. Gli animali

1. Mantenere il wild-type zebrafish (Danio rerio) del ceppo AB (Oregon) di età compresa tra 6-12 mesi in condizioni standard in acqua con una temperatura di 26,5 ° C e un 14/10 luce hr / ciclo scuro ^15.
2. Seguire le linee guida per la cura degli animali delle istituzioni coinvolte per gli esperimenti sugli animali dopo l'approvazione da parte dell'Ufficio cantonale di veterinaria.

2 MNU Trattamento

1. Preparare acqua contenente 150 mg / l di sostanza secca di N -methyl- N -nitrosourea (MNU). ATTENZIONE! MNU è tossico; può provocare il cancro, alterazioni genetiche ereditarie o danneggiare i bambini non ancora nati.
2. Incubare zebrafish in acqua contenente la MNU per 60 minuti a temperatura ambiente.
3. Sciacquare zebrafish rapidamente conacqua dolce e mettere il pesce in un nuovo serbatoio di pesce senza MNU. Mantenere i pesci in condizioni standard il tempo desiderato per gli esperimenti.

3. acuità visiva di misura

1. Avviare il sistema optomotor, scegliere 'testing' dal menu e impostare le opzioni di "Simple Staircase", "Acuity (Freq)" e "Randomized / separato" ^16.
2. Installare una bottiglia di infusione riempita con 500 ml di acqua circa 1 m sopra il sistema optomotor.
3. Mettere uno zebrafish nella camera di esame e collegarlo alla bottiglia di infusione. Posizionare la camera di esame nel sistema optomotor.
4. Avviare la misura e osservare il movimento degli occhi in tempo reale sullo schermo del computer. In tal modo, una risposta positiva ("sì") è definito come saccadi consecutive nella direzione giusta, mentre una risposta negativa ("no") rappresenta movimenti casuali degli occhi simili a quelli osservati con la stazionegrigliati ary. Se gli occhi della mostra zebrafish tre o più successive risposte optokinetic (okr), premere 'sì'; se non, premere 'no'.
5. Estrarre l'acuità visiva, che è stato calcolato dal software determinando la soglia della frequenza spaziale dello stimolo optocinetico, alla voce "Risultati" nel menu.

4. Istologia

1. Euthanize il zebrafish da un'overdose di etil 3-aminobenzoato methanesulfonate (200-300 mg / L) e di enucleare gli occhi.
2. Fissare l'intero occhi in 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C per 12 ore e poi disidratare i campioni in una serie graduata di alcol.
3. Incorpora i campioni in paraffina, tagliati 5 micron sezioni attraverso la testa del nervo ottico (TNO) e montarli su un vetrino.
4. Colorare le sezioni di paraffina deparaffized con hemalum per 4 min e immergere i vetrini due volte in acqua distillata seguita da 0,2% aci cloridricod e 0,8% di ammoniaca. Colorare le sezioni con eosina per 3 minuti dopo lo sviluppo della colorazione hemalum in acqua di rubinetto per almeno 10 min (H & E).
5. Incorporare le diapositive disidratati in mezzo di montaggio e osservare i vetrini al microscopio luce.

5. Immunoistochimica

1. Terminal deossinucleotidil transferasi etichettatura fine dUTP nick (TUNEL)
   1. Incubare le sezioni deparaffinate con 20 mg / ml di proteinasi K a temperatura ambiente per 15 min. Lavare le sezioni tre volte con Tris Buffered Saline (TBS) per 5 minuti ciascuno.
   2. Incubare le sezioni con 50 microlitri miscela di reazione TUNEL (soluzione di etichettatura 10% e soluzione enzimatica del 90%) in una camera umidificata a 37 ° C per 60 min. Lavare tre volte con TBS per 5 minuti ciascuno.
   3. Montare i vetrini con terreno contenente DAPI montaggio e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza.
2. Nucleare di cellule proliferative Antigen (PCNA) colorazione
   1. Lessare le sezioni deparaffinate nel buffer di recupero dell'antigene (Tris-EDTA + 0,05% Tween 20, pH 9.0) per 3 minuti e lavare tre volte con TBS per 5 minuti ciascuno. Blocco con 100 microlitri di blocco a temperatura ambiente la soluzione (TBS + 10% di siero di capra normale + 1% di albumina sierica bovina, pH7.6) per 1 ora.
   2. Macchia con anti-PCNA anticorpi primari in una diluizione 1: 200 in una camera umidificata a 4 ° C per una notte. Lavare tre volte con TBS + Tween 20 per 5 minuti ciascuna.
   3. Termina la rilevazione con gli appropriati anticorpi secondari in una diluizione 1: 500 a temperatura ambiente per 1 ora.
   4. Montare i vetrini con terreno contenente DAPI montaggio e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza.

Risultati

Acuità visiva:

Il set-up sperimentale [frequenza spaziale: 0.042 circoli / grado (c / d); contrasto: 100%; velocità di deriva: 20 gradi / secondo (d / src); indietro luminanza luce: 152 cd / m ^2] di questo studio ha permesso la valutazione okr di zebrafish adulto. La durata media della misurazione VA era circa 5-10 minuti per ogni zebrafish, che tollerato bene la procedura. L'acuità visiva prima dell'esposizione MNU era 0,577 ± 0,014 cicli / grado (c / d). Figu...

Discussione

In precedenza, il nostro gruppo ha trasferito il modello MNU di degenerazione dei fotorecettori dai roditori nel sistema zebrafish ^9. Gli eventi successivi sono stati descritti e seguiti fino a 30 giorni. In questo periodo di tempo completa degenerazione morfologica della retina e la rigenerazione avvenuti dopo il trattamento iniziale. In primo luogo, istologia rivela una conta di cellule asta ridotto da 3 giorni su con un minimo al giorno 8 Corrispondentemente, TUNEL colorazione identifica l'apoptosi dei...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A6283
Ammonia	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	294993	0.80%
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	05470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	45260
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860	100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	E10521	Tricaine
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit Alexa 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11012
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	320331	0.20%
In situ Cell Death Detection Kit	Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland	11684795910	TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution	Merck, Darmstadt, Germany	109249
Methylnitrosourea (MNU)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	N4766	Toxic
OptoMotry	CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada	n.a.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Proteinase K	Dako, Glostrup, Danmark	S3004
Rabbit anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA	sc-33756
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Trizma base	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	T1503
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain	University of Fribourg, Dept. of Biology	n.a.	Own fish facility