JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Abstract

سريريا، والعلاج مع استخدام التخثر المؤتلف منشط البلازمينوجين النسيجي (TPA) يبقى العلاج الأكثر فعالية للسكتة الدماغية الحادة. ومع ذلك، فإن استخدام سكتة محدودة بسبب الإطار الخاص العلاجي الضيق وزيادة خطر التحول النزفية. هناك حاجة ملحة لتطوير نماذج مناسبة لدراسة السكتة الدماغية وكلاء الحالة للخثرة واستراتيجيات جديدة لعلاج السكتة الدماغية. في الوقت الحاضر، وقد وضعت نوعان رئيسيان من السكتة الدماغية في نماذج الفئران والجرذان: خياطة داخل اللمعة MCAO وصمي MCAO. على الرغم من أن النماذج MCAO عبر تقنية خياطة داخل اللمعة استخدمت على نطاق واسع في الأبحاث السكتة الدماغية يحركها آلية، هذه النماذج خياطة لا تحاكي الوضع الإكلينيكي، وهي ليست مناسبة لدراسات الحالة للخثرة. من بين هذه النماذج، نموذج MCAO الصمي يحاكي بشكل وثيق السكتة الدماغية الإنسان وغير مناسبة لتحقيق قبل السريرية للعلاج التخثر. وتم تطوير هذا النموذج صمي أولا في الفئران عن طريق ربوتكأergaard وآخرون. 1 في عام 1992، وتميزت بمزيد من تشانغ وآخرون في عام 1997 2. على الرغم من الصمي MCAO اكتسبت اهتماما متزايدا، وهناك مشاكل الفنية التي تواجه العديد من المختبرات. لتلبية الاحتياجات المتزايدة لبحوث الحالة للخثرة، نقدم نموذجا استنساخه للغاية من الصمي MCAO في الفئران، والتي يمكن أن تتطور حجم احتشاء يمكن التنبؤ به داخل أراضي MCA. باختصار، وتقدم على تعديل PE-50 أنبوب بلطف من الشريان السباتي الخارجي (ECA) في تجويف الشريان السباتي الداخلي (ICA) حتى غيض من القسطرة يصل إلى أصل MCA. من خلال القسطرة، يتم وضع واحدة تجلط الدم متماثلة في أصل MCA. لتحديد نجاح انسداد MCA، تم رصد الإقليمي تدفق الدم في الدماغ، تم قياس العجز العصبية وحجم احتشاء. يجب التقنيات المعروضة في هذه الورقة تساعد المحققين على التغلب على المشاكل التقنية لإنشاء هذا النموذج للبحث السكتة الدماغية. </ P>

Introduction

السكتة الدماغية هي ثالث سبب رئيسي للوفاة في الولايات المتحدة، ولكن تبقى الخيارات المتاحة لعلاج السكتة الدماغية الحادة محدودة. في الوقت الحاضر، التسريب في الوريد المؤتلف منشط البلازمينوجين النسيجي (TPA) لإذابة جلطات الدم هو العلاج الأكثر فعالية للسكتة الدماغية الحادة. ومع ذلك، فإن استخدام سكتة محدودة بسبب الإطار الخاص العلاجي الضيق وزيادة خطر النزف داخل المخ. وبالتالي، هناك حاجة ماسة لنموذج من السكتة الدماغية مناسبة للبحث التخثر.

الشريان الدماغي الأوسط (MCA) هو الشريان في معظم الأحيان المغطي في المخ لدى البشر. ركز على هذا الشريان، وقد أنشئت العديد من النماذج الحيوانية من السكتة الدماغية. في الوقت الحاضر، وقد وضعت نوعين رئيسيين من القوارض البؤري نماذج نقص التروية التي تسد MCA: خياطة MCAO نموذج وصمي MCAO نموذج. على الرغم من أن النماذج MCAO عبر تقنية خياطة داخل اللمعة وقد استخدمت على نطاق واسع في الأبحاث السكتة الدماغية آلية يحركها، وهذه النماذج لا خياطةوتحدث السكتة الدماغية الإنسان تقليد، ما يصل إلى 80٪ من السكتات الدماغية الإنسان من قبل الجلطة أو الانسداد. ومع ذلك، باستخدام نموذج السكتة الدماغية الصمي الجلطات الدموية والسكتة الدماغية عن كثب يحاكي الإنسان وتعتبر مناسبة لدراسة الحالة للخثرة. وتم تطوير هذا النموذج صمي أولا في الفئران عن طريق Overgaard وآخرون. 1 في عام 1992 وزيادة تتميز تشانغ وآخرون في عام 1997 2 وDinapoli وآخرون في عام 2006 3. على الرغم من الصمي MCAO اكتسبت اهتماما متزايدا، وهناك مشاكل فنية واجهت من قبل العديد من المختبرات.

في هذه المقالة، نحن يبرهن على وجود طريقة موحدة لإنتاج الصمي MCAO مع جلطات الدم متماثلة في الفئران الكبار، والتي يمكن تطوير احتشاء يمكن التنبؤ به داخل أراضي MCA. يجب التقنيات المعروضة في هذه المقالة تساعد المحققين على التغلب على المشاكل التقنية لإنشاء هذا النموذج للبحث السكتة الدماغية.

Protocol

واستخدمت الفئران الذكور البالغين سبراغ داولي (وزنها 330-380 ز) في هذا البروتوكول: بيان الأخلاق. تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في مركز العلوم الصحية LSU-شريفيبورت ومتوافق مع 'دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "(الطبعة الثامنة، والأكاديمية الوطنية للعلوم، 2011 ).

1. إعداد التعديل أنبوب PE-50

  1. عقد 30 سم أنبوب طويل PE-50 فوق النار الغاز عن طريق اليدين وتخفيف تدريجيا الأنبوب. تمتد الأنبوب بلطف.
  2. تحديد نقطة على أنبوب امتدت باستخدام الفرجار الرقمية (الشكل 1)، علامة عليه، وقطع تعديل PE-50 أنبوب إلى 25 سم قطعة طويلة مع طرف 1 سم طويل (خارج القطر: 0،30-0،34 مم).

2. إعداد مثلي الجلطات الدموية

  1. تخدير الفئران مع isoflurane (5٪ لتحريض، 2-3٪ للصيانة) في 70٪ N 2 O و 30٪ O <الفرعية> 2 بواسطة قناع الوجه قبل جمع الدم. تأكيد التخدير عن طريق قرصة أخمص قدميه.
  2. إجراء القسطرة الشريانية الفخذ من الفئران المانحة مع طريقة نشرت 4 الشريان الفخذي ونقل الدم مباشرة إلى 20 سم طويلة PE-50 أنبوب. وضع أنبوب لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة لجلطة في الدم، ومن ثم الإبقاء على الأنبوب لمدة 22 ساعة في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يتم إجراء القسطرة باستخدام تقنية العقيم كما هو موضح في الخطوة 3.1. يتم استرداد الفئران المانحة للحصول على مزيد أخذ العينات.
  3. قطع أنبوب PE-50 إلى 50 مم شرائح وطرد الجلطة من الأنبوب في طبق بتري معقمة تحتوي على محلول ملحي.
  4. نقل 50 مم تجلط طويلة إلى 60 ملم طويلة PE-10 أنبوب وربط كل نهاية الأنبوب PE-10 إلى 20 سم طويلة PE-50 أنبوب متصل 1 مل حقنة تحتوي على محلول ملحي مع 23 G إبرة (الشكل 2) .
  5. تحويل تجلط بواسطة بالتناوب حركة مستمرة من حقنة واحدة إلى أخرى لمدة 5 دقائق، والتي يمكن إزالة خلايا الدم منالجلطة والتقليل من هشاشة جلطة متخثر خارج الأوعية، دون تعطيل جوهر الفيبرين.
  6. قطع الجلطة إلى 40 ملم شريحة طويلة ونقل جزء جلطة في تعديل PE-50 قسطرة كما هو موضح في الخطوة 1.2 تحت ظروف معقمة. ملاحظة: يتم تعقيم جميع PE أنابيب مع أكسيد الإيثيلين.

3. الصمي الأوسط انسداد الشريان الدماغي (الشكل 3A، B)

  1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية بواسطة التعقيم (الحد الأدنى 121 درجة مئوية، 15 PSI، لمدة 15 دقيقة). تطهير طاولة الجراحة والمعدات الجراحية المرتبطة باستخدام الايثانول 70٪.
  2. تخدير الفئران مع isoflurane كما هو موضح في الخطوة 2.1. اختبار عمق التخدير عن طريق إجراء قرصة اصبع القدم على كلا القدمين الخلفية، وأية حركة لاحظ (سحب مخلب) إلى أن الحيوان ليس تخدير بما فيه الكفاية للقيام الجراحة. ضع كمية صغيرة من مرهم الطبيب البيطري في كلتا العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. حلق الفراء على بطني الرقبة والرأس إعادةالمنطقتين مع كليبرز الكهربائية لفضح مناطق الجلد.
  3. وضع الفئران في موقف ضعيف على وسادة التدفئة. إدراج المستقيم التحقيق والرقابة والحفاظ على درجة حرارة الجسم بين 36.5-37.5 درجة مئوية باستخدام وحدة التحكم بطانية homeothermic.
  4. تطهير الجلد والفرو المحيطة حلق مع 10٪ بوفيدون اليود تليها الايثانول 70٪.
  5. جعل شق خط الوسط 2 سم طويلة على الرقبة تحت المجهر تشريح. استخدام الكامشات لفضح مجال الجراحة وتشريح الصحيح الشريان السباتي المشترك (CCA)، الشريان السباتي الخارجي (ECA)، الشريان السباتي الداخلي (ICA)، والشريان الحنكي (PPA) خالية من الأعصاب المحيطة والواجهة (الشكل 3A). ملاحظة: قبل الجراحة، وتغيير القفازات المعقمة إذا لم يكن هناك مساعد يساعد على إعداد الحيوان.
  6. تشريح CCA خالية من الأعصاب المحيطة (دون الإضرار العصب المبهم) ووضع معقمة 5-0 خياطة الحرير تحت الشريان. ربط عقدة زلة (رقم 1) وفهم خياطة باستخدام hemos صغيرالمتبادل وتدرس سحب نحو الجسم.
  7. تشريح اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وفرعيها، الشريان القذالي (OA) والشريان متفوقة الغدة الدرقية (STA). تخثر فرعين باستخدام وحدة الكهربائية البيطرية. وضع قطعتين من خيوط الحرير 6-0 معقمة تحت اللجنة الاقتصادية لأفريقيا.
  8. تفصل بين الحرائر وضعت تحت الشريان، قطعة واحدة نحو الرأس (النهاية البعيدة) والآخر نحو الجسم. ربط ربطة ضيق (رقم 2) على الجانب الأقرب إلى الرأس، فهم الحرير مع المرقأة الصغيرة وتدرس سحب نحو الرأس. تحضير عقدة فضفاضة (رقم 3) مع الحرير آخرين لاستخدامها لاحقا.
  9. تشريح ICA والمؤسسة العامة للتقاعد من الأعصاب المحيطة (دون الإضرار العصب المبهم). ربط المؤسسة العامة للتقاعد مع خياطة 6-0 (# 4). جعل عقدة زلة مع 6-0 خياطة حول ICA (رقم 5). بدلا من ذلك، مقطع ICA باستخدام مقطع الاوعية الدموية الدقيقة.
  10. قطع ثقب صغير (1/2 من خلال) في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا بين ضيق (رقم 2) وفضفاضة (# 3) اربطة مع مقص الربيع على غرار Vannas. إدراج تعديل PE-50 حوضالبريد تحتوي على تجلط الدم في شق وتقدم إلى التشعب التقييم القطري المشترك. تشديد ربطة فضفاض (رقم 3) حول التجويف فقط ما يكفي لضمان الحفاظ على التنقل من الأنبوب التي تعيش فيها.
  11. قطعت اللجنة الاقتصادية لأفريقيا في موقع ثقب صغير لتحرير جدعة جدعة ووضع تحت التشعب من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وICA. هذا سوف يسمح الأنبوب تعديل الانزلاق بسهولة في ICA. فتح ICA ودفع بلطف الأنبوب من تجويف اللجنة الاقتصادية لأفريقيا في ICA حتى غيض من القسطرة يصل أصل MCA (~ 17 ملم من التشعب). ملاحظة: قبل إدراج غيض من أنبوب في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، معقمة السطح الخارجي للأنبوب مع الايثانول 70٪، ثم تغسل مع المياه المالحة طبيعية معقمة.
  12. حقن جلطة من خلال تعديل PE-50 قسطرة جنبا إلى جنب مع 10 ميكرولتر من المياه المالحة أكثر من 10 ثانية باستخدام 100 ميكرولتر حقنة هاميلتون (الشكل 3B).
  13. سحب القسطرة من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا بعد 5 دقائق. ربط اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وإعادة فتح CCA. خياطة شق على الرقبة.

4. الرصد الإقليمية تدفق الدم الدماغي (rCBF)

  1. قبل MCA انسداد، وجعل شق خط الوسط 1.2 سم في فروة الرأس لفضح عظم الجمجمة. إزالة الأنسجة على عظم الجمجمة مع مكشطة الأسنان ومقايضة القطن المعقمة. ملاحظة: قبل الجراحة، وتطهير منطقة فروة الرأس المكشوفة والفراء المحيطة مع 10٪ بوفيدون اليود تليها الايثانول 70٪.
  2. حفر حفرة قطرها 1.5 ملم لدغ يقع في 2 ملم و 5 ملم الخلفي الجانبي إلى bregma باستخدام 0.7 ملم كروية لدغ الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 4).
    ملاحظة: حافظ على الجافية سليمة.
  3. وضع المسبار 0.5 ملم فوق سطح الجافية. مراقبة rCBF عند 0 (خط الأساس)، 5، 15، 30، 60، 90، و 120 دقيقة بعد الانصمام والاستمرار في 5، 15، 30، 45، و 60 دقيقة بعد الوريد من سكتة. بعد القياس الأخير من rCBF، يتم إغلاق شق فروة الرأس من قبل خياطة. ملاحظة: قبل شق الرقبة نقيس rCBF كما خط الأساس قبل MCA occlusأيون. آخر MCA انسداد نقيس rCBF بعد إغلاق خياطة شق الرقبة. وبالتالي، يتم الاحتفاظ شق الرقبة العقيمة.

العناية 5. بعد المنطوق

  1. حقن 2.5 مل من محلول ملحي تحت الجلد لمنع الجفاف وحقن Buprenex (0.05 مغ / كغ، SC) على الفور بعد الجراحة وكل 6-12 ساعة حسب الحاجة لتخفيف الألم.
  2. وقف التخدير الأيزوفلورين. وضع فأر في غرفة 37 درجة مئوية الانتعاش البيطري (تدفئة الحيوان) والحفاظ على الملاحظة. يستغرق عادة 10 دقيقة للالفئران على التعافي من التخدير. ثم، وضع الحيوان في قفص تعقيمها، ضع بعض الطعام المبللة في طبق بيتري في القفص، والعودة إلى القفص غرفة تعقيم الحيوانات.
  3. 24 ساعة بعد السكتة الدماغية، والموت ببطء مع الفئران جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال (100 ملغ / كغ من وزن الجسم، IP).

6. العصبية العجز النتيجة

  1. أداء النتيجة Bederson قبل وعند 2 ساعة بعد الانصمام. استخدام ق الدرجاتكال من 0-3 كما هو موضح سابقا 5: 0، رفع الفئران عن طريق الذيل، والحيوان على حد سواء الأمامية تمتد على الارض واظهار أي عجز الأخرى (الحركة الطبيعية). 1، ورفع الفئران عن طريق الذيل، وثني forelimb المقابل. 2، وانخفاض مقاومة الضغط الجانبي (وforelimb انثناء) دون تحلق. 3، وهو نفس السلوك كما الصف 2 مع الدوران.
    يتم استبعاد الفئران تبين Bederson النتيجة = 0 (أي العجز) في 2 ساعة بعد الانصمام من مزيد من الدراسة: ملاحظة.

النتائج

تم استخدام الليزر دوبلر flowmetry (LDF) لمراقبة rCBF خلال تحريض نقص التروية الدماغية 6،7. العديد من المختبرات بما في ذلك المختبر لدينا وقد تم استخدام rCBF لتحديد الحيوانات الناجح مع انسداد MCA، ولكن عتبات الأساس تنوعت بين المختبرات التي هي ذات الصلة إلى موقع القياس. يتم وضع ...

Discussion

في هذه الدراسة، أثبتنا طريقة موحدة لإجراء عملية MCAO نموذج السكتة الدماغية الصمي في الفئران، حيث يتم المغطي أصل MCA من جلطة الليفين الغني. والميزة الرئيسية لهذا النموذج هي: انسداد تنبع من MCA مع تجلط الدم الليفين الغني يشبه السكتة الدماغية الانسداد التجلطي في البشر، ونمو...

Disclosures

We do not have any potential conflicting interests to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health grants HL087990 (G.L.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
rh-tPAChemicalGenentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chlorideChemicalSigmaT8877
Anesthesia vaporizerEquipmentSoma TechnologyDrager Vapor 19.1  
Rechargeable high speed micro drillEquipmentFine Science Tools18000-17
Curved scissorsEquipmentFine Science Tools14117-14
Dumont forceps (Medical #7)EquipmentFine Science Tools11270-20
Dumont forceps (Medical #5)EquipmentFine Science Tools11251-35
Vannas-style spring scissorsEquipmentFine Science Tools15000-03
Veterinary recovery chamber Equipment Peco Services V1200  
Genie plus syringe pumpEquipmentKent Scientific Corporation
Rat brain matrixEquipmentKent Scientific CorporationRBMA-310C
Digital caliper EquipmentWorld Precision Instruments501601
Dissecting microscopeEquipmentWorld Precision InstrumentsPZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringeEquipmentHamiltonmodel 710
Homeothermic blanket control unitEquipmentHarvard Apparatus
Electric clipperEquipmentBraintree ScientificCLP-9931
Veterinary electrosurgical unitEquipmentMACAN Manufacturing CompanyMV-9
Blood flowmeterEquipmentAdinstruments
PowerLab 4/30EquipmentAdinstruments
LabChart 7.2softwareAdinstruments
1 ml syringeConsumableBecton, Dickinson and Company309659
23 G needleConsumableBecton, Dickinson and Company305143
30 G needleConsumableBecton, Dickinson and Company305106
PE-50 tubingConsumableBecton, Dickinson and Company427517
PE-10 tubingConsumableBecton, Dickinson and Company427400
6-0 Silk sutureConsumableHarvard apparatus723287
5-0 Silk sutureConsumableHarvard Apparatus517607

References

  1. Overgaard, K., Sereghy, T., Boysen, G., Pedersen, H., Høyer, S., Diemer, N. H. A rat model of reproducible cerebral infarction using thrombotic blood clot emboli. J Cereb Blood Flow Metab. 12 (3), 484-490 (1992).
  2. Zhang, R. L., Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q., Ewing, J. R. A rat model of focal embolic cerebral ischemia. Brain Res. 766 (1-2), 83-92 (1997).
  3. Dinapoli, V. A., Rosen, C. L., Nagamine, T., Crocco, T. Selective MCA occlusion: a precise embolic stroke model. J. Neurosci. Methods. 154 (1-2), 233-238 (2006).
  4. Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J Vis Exp. 59 (3496), (2012).
  5. Bederson, J. B., Pitts, L. H., Tsuji, M., Nishimura, M. C., Davis, R. L., Bartkowski, H. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17 (3), 472-476 (1986).
  6. Henninger, N., Bouley, J., Bråtane, B. T., Bastan, B., Shea, M., Fisher, M. Laser Doppler flowmetry predicts occlusion but not tPA-mediated reperfusion success after rat embolic stroke. Exp Neurol. 215 (2), 290-297 (2009).
  7. Zhu, H., et al. Annexin A2 combined with low-dose tPA improves thrombolytic therapy in a rat model of focal embolic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (6), 1137-1146 (2010).
  8. Cheng, T., et al. Activated protein C inhibits tissue plasminogen activator-induced brain hemorrhage. Nat Med. 2 (11), 1278-1285 (2006).
  9. Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. 21 (955), (2008).
  10. Sicard, K. M., Fisher, M. Animal models of focal brain ischemia. Exp Transl Stroke Med. 1 (7), (2009).
  11. Florian, B., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
  12. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
  13. Westendorp, W. F., Nederkoorn, P. J., Vermeij, J. D., Dijkgraaf, M. G., van de Beek, D. Post-stroke infection: a systematic review and meta-analysis. BMC Neurol. 11 (110), (2011).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats
Posted by JoVE Editors on 11/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats. The institution information was updated.

The institution "Louisiana State University Health Science Center" was changed to "Louisiana State University Health Science Center, Shreveport".

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

91

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved