Embolischen mittleren Hirnarterie Okklusion (MCAO) für ischämischen Schlaganfall mit homologen Blutgerinnsel in Ratten

Zusammenfassung

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Zusammenfassung

Klinisch thrombolytische Therapie unter Verwendung von rekombinantem Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA), bleibt die effektivste Behandlung für akuten ischämischen Schlaganfall. Jedoch wird die Verwendung von tPA durch ihre geringe therapeutische Breite und erhöhtes Risiko hämorrhagischer Transformation beschränkt. Es ist dringend notwendig, um die passenden Taktmodelle zu entwickeln, um neue Thrombolytika und Strategien für die Behandlung von ischämischen Schlaganfall zu untersuchen. Intraluminalen Naht MCAO und Embolie MCAO: Derzeit sind zwei Haupttypen von ischämischen Schlaganfall-Modelle bei Ratten und Mäusen entwickelt. Obwohl MCAO Modelle über die intraluminale Nahttechnik sind weit verbreitet in Mechanismus angetriebenen Schlaganfallforschung verwendet, sind diese Modelle nicht Naht die klinische Situation zu imitieren und sind nicht geeignet für Thrombolytika Studien. Unter diesen Modellen, die Embolie MCAO-Modell imitiert menschliche ischämischen Schlaganfall und ist geeignet für die präklinische Untersuchung der Thrombolyse-Therapie. Dieses Modell wurde erstmals embolischen bei Ratten durch Ov entwickeltergaard et al. ¹ 1992 und weiter gekennzeichnet durch Zhang et al. 1997 ^2. Obwohl Embolie MCAO hat zunehmende Aufmerksamkeit erlangt, gibt es technische Probleme von vielen Laboratorien konfrontiert. Um den steigenden Bedarf an Thrombolytika Forschung gerecht zu werden, stellen wir eine hoch reproduzierbare Modell der embolischen MCAO bei der Ratte, die eine vorhersagbare Infarktvolumen innerhalb der MCA Gebiet entwickeln. Kurz gesagt wird eine modifizierte PE-50-Rohr sanft von der äußeren Halsschlagader (ECA) drangen in das Lumen der A. carotis interna (ICA), bis die Spitze des Katheters erreicht, den Ursprung der MCA. Durch den Katheter wird eine einzelne homologe Blutgerinnsel im Ursprung der MCA gegeben. Um den Erfolg der MCA-Okklusion zu identifizieren, regionale zerebrale Blutfluss überwacht wurde, wurden neurologische Defizite und der Infarktvolumen gemessen. Die in diesem Papier vorgestellten Techniken sollten die Ermittler auf technische Probleme für die Einrichtung dieses Modell für Schlaganfall-Forschung zu überwinden helfen. </ P>

Einleitung

Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten, aber die Behandlungsmöglichkeiten für akute Schlaganfall bleiben begrenzt. Derzeit ist die intravenöse Infusion von rekombinantem Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA), die Blutgerinnsel auflösen die effizienteste Behandlung für akuten ischämischen Schlaganfall. Jedoch wird die Verwendung von tPA durch ihre geringe therapeutische Breite und durch erhöhte Gefahr von intrazerebralen Blutungen beschränkt. Deshalb wird ein Modell des Schlaganfalls geeignet für Thrombolytika Forschung dringend notwendig.

Die Arteria cerebri media (MCA) ist die Arterie am häufigsten in der Schlaganfall bei Menschen verschlossen. Auf dieser Arterie konzentriert, haben viele Tiermodelle für einen ischämischen Schlaganfall festgestellt. Derzeit sind zwei Haupttypen von Nagetier fokale Ischämie Modelle von Verschließen MCA entwickelt: Naht MCAO-Modell und Embolie MCAO-Modell. Obwohl MCAO Modelle über die intraluminale Nahttechnik sind weit verbreitet in Mechanismus angetriebenen Schlaganfallforschung verwendet, diese Naht Modelle nichtmimic menschlichen Schlaganfall, da bis zu 80% der menschlichen Schlaganfälle werden durch Thrombose oder Embolie verursacht. Allerdings embolischen Schlaganfall-Modell mit Blutgerinnseln imitiert menschliche Schlaganfall und wird als geeignet für Thrombolytika Studie. Diese Emboliemodell wurde in Ratten durch Overgaards et al. ¹ 1992 1997 ² und Dinapoli et al 2006 ³ entwickelt und ferner gekennzeichnet durch Zhang et al... Obwohl Embolie MCAO hat zunehmende Aufmerksamkeit erlangt, gibt es technische Probleme konfrontiert von vielen Labors.

In diesem Artikel zeigen wir ein Standard-Verfahren zur Herstellung von embolischen MCAO mit homologen Blutgerinnsel in der erwachsenen Ratte, die eine vorhersagbare Infarkt im MCA Gebiet entwickeln. Die in diesem Artikel vorgestellten Techniken sollen helfen Ermittler auf technische Probleme für die Einrichtung dieses Modell für Schlaganfall-Forschung zu überwinden.

Protokoll

Ethik-Erklärung: Männliche Erwachsene Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht 330-380 g) wurden in diesem Protokoll verwendet. Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der LSU Health Science Center-Shreveport anerkannt und ist in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (achte Auflage Nationalen Akademie der Wissenschaften 2011 ).

1. Herstellung von modifiziertem PE-Rohr 50

1. Halten Sie eine 30 cm lange PE-Rohr 50 über einem Gasfeuer durch die Hände, allmählich erweichen die Röhre. Dehnen Sie vorsichtig das Rohr.
2. Wählen Sie einen Punkt auf der gestreckte Schlauch mit Hilfe eines digitalen Messschieber (Abbildung 1), markieren Sie es, und schneiden Sie die modifizierte PE-50 Rohr in einen 25 cm langen Segment mit einem 1 cm langen Spitze (Außendurchmesser: 0,30 bis 0,34 mm).

2. Herstellung der homologen Blutgerinnsel

1. Betäuben die Ratten mit Isofluran (5% zur Einleitung, 2-3% für Wartungsarbeiten) in 70% N ₂ O und 30% O _{2 durch eine Gesichtsmaske vor der Blutentnahme. Bestätigen Narkose durch eine Zehe Prise.}
2. Führen Oberschenkelarterien Kanülierung einer Spenderratte mit veröffentlichten Verfahren ⁴ und übertragen Oberschenkelarterie Blut direkt in ein 20 cm langes Rohr PE-50. Das Röhrchen wird für 2 h bei Raumtemperatur gerinnen Blut, und bewahren das Rohr für 22 Stunden bei 4 ° C ist. Hinweis: Kanülierung wird unter aseptischen Bedingungen wie in Schritt 3.1 beschrieben durchgeführt. Die Spenderratte für weitere Abtastung gewonnen.
3. Schneiden Sie das PE-Rohr 50 in 50 mm Segmente und spülen, die Blutgerinnsel aus der Röhre in eine sterile Petrischale mit physiologischer Kochsalzlösung.
4. Übertragen Sie die 50 mm lange Gerinnsel in eine 60 mm lange PE-Rohr 10 und verbinden jedes Ende des PE-Rohr 10 zu einem 20 cm langen PE-Rohr 50 zu 1 ml Spritze verbunden enthält normaler Kochsalzlösung mit 23 G-Nadel (Abbildung 2) .
5. Verschieben das Gerinnsel durch Dauerwechsel Bewegung von einer Spritze auf die andere für 5 min, die Blutzellen aus zu entfernen, kanndas Gerinnsel und minimieren die fragile von extravaskulären geronnenen Gerinnsel, ohne dass der Kern Fibrin.
6. Schneiden Sie das Gerinnsel in ein 40 mm langes Segment und das Gerinnsel Segment übertragen in eine modifizierte PE-50-Katheter, wie in Schritt 1.2 unter aseptischen Bedingungen beschrieben. Anmerkung: Alle PE-Schlauch ist mit Ethylenoxid sterilisiert.

3. Embolie mittleren Hirnarterie Okklusion (3A, B)

1. Sterilisieren alle chirurgischen Werkzeugen durch Autoklavieren (mindestens 121 ° C, 15 PSI, 15 min). Desinfizieren dem OP-Tisch und die damit verbundenen chirurgischen Geräten mit 70% Ethanol.
2. Betäuben die Ratte mit Isofluran, wie in Schritt 2.1 beschrieben. Testen Sie die Narkosetiefe, indem eine Zehe Prise auf beiden hinteren Füße, und jede Bewegung beobachtet (Zurückziehen der Pfote) zeigt an, dass das Tier nicht ausreichend narkotisierten der Operation zu tun. Tragen Sie eine kleine Menge der Tierarzt Salbe auf beiden Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Rasieren das Fell an der ventralen Hals und Kopf wiederRegionen mit elektrischen Haarschneider, um die Bereiche der Haut zu schützen.
3. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf einem Heizkissen. Legen Sie eine rektale Sonde, Überwachung und Pflege der Körpertemperatur zwischen 36,5 bis 37,5 ° C mit einem homöothermen Decke Steuereinheit.
4. Desinfizieren Sie die rasierte Haut und die umliegenden Fell mit 10% PVP-Jod, gefolgt von 70% Ethanol.
5. Machen Sie eine 2-cm-lange Mittellinienschnitt am Hals unter einem Binokular. Wundhaken verwenden, um das Operationsfeld freizulegen und zu sezieren die rechte Arteria carotis communis (CCA), A. carotis externa (ECA), der A. carotis interna (ICA) und pterygopalatinum Arterie (PPA) frei von umliegenden Nerven und Faszien (3A). Hinweis: Vor der Operation ändern sterile Handschuhe, wenn kein Assistent hilft, um das Tier vor.
6. Sezieren die CCA frei von den umliegenden Nerven (ohne Schädigung der Vagus-Nerv) und legen Sie eine sterile 5-0 Seidenfaden unter der Arterie. Binden Sie ein Belegknoten (# 1) und fassen Sie den Faden mit einem kleinen hemostat und ziehen in Richtung des Körpers vermittelt.
7. Präparieren Sie die ECA und ihre zwei Zweige, die A. occipitalis (OA) und die A. thyroidea superior (STA). Gerinnen zwei Zweige mit einem Tierelektrochirurgiegerät. Legen Sie zwei Stücke von sterilen 6-0 Seidenfäden unter der ECA.
8. Trennen Sie die beiden Seiden unter der Arterie, ein Stück in Richtung des Kopfes (distalen Ende) und der andere in Richtung des Körpers platziert. Binden Sie eine enge Ligatur (# 2) auf der Seite, die dem Kopf, fassen Sie die Seide mit kleinen Gefäßklemmen und ziehen in Richtung des Kopfes unterrichtet. Bereiten Sie einen lockeren Knoten (# 3) mit der anderen Seide später verwenden.
9. Präparieren Sie die ICA und PPA aus den umliegenden Nerven (ohne Schädigung der Vagus-Nerv). Binden Sie die PPA mit einem 6-0 Faden (# 4). Machen Sie eine Laufknoten mit 6-0 Naht um den ICA (# 5). Alternativ Clip des ICA mit einem mikrovaskulären Clip.
10. Schneiden Sie ein kleines Loch (02.01 bis) in den ECA zwischen der fest (# 2) und lose (# 3) Ligaturen mit Vannas-Stil Frühjahr Schere. Legen Sie die modifizierte PE-Wanne 50E enthält, Blutgerinnsel in den Einschnitt und in die Gabelung des CCA. Ziehen Sie die lose Ligatur (# 3) um die Lumen gerade genug, um zu sichern bewahren Mobilität der in lebenden Röhre.
11. Schneiden Sie die ECA an der Stelle der kleinen Loch, um den Stumpf zu befreien und positionieren Sie den Stumpf unterhalb der Gabelung der ECA und ICA; dies ermöglicht die modifizierte Rohr einfach in die ICA gleiten. Öffnen Sie die ICA und sanft voran den Schlauch aus dem Lumen des ECA in die ICA, bis die Spitze des Katheters die Herkunft des MCA erreicht (~ 17 mm von der Bifurkation). Hinweis: Bevor Sie die Spitze der Röhre in die ECA, sterile der Außenfläche der Röhre mit 70% Ethanol und dann mit steriler physiologischer Kochsalzlösung zu waschen.
12. Injizieren das Gerinnsel durch die modifizierte PE-50-Katheter zusammen mit 10 ul Kochsalzlösung über 10 s mit einer 100 ul-Hamilton-Spritze (3B).
13. Ziehen Sie den Katheter aus dem ECA 5 min später. Binden Sie die ECA und öffnen CCA. Naht der Schnitt am Hals.

4. Überwachung regionale Hirndurchblutung (rCBF)

1. Vor der MCA-Okklusion, machen Sie eine 1,2 cm lange Mittellinienschnitt in der Kopfhaut, den Schädelknochen aus. Entfernen Sie die Gewebe auf der Schädelknochen mit einer Zahn Schaber und sterilen Wattestäbchen. Anmerkung: Vor der Operation werden die freigelegten Kopfhaut und der umgebenden Fell mit 10% Povidon-Iod, gefolgt von 70% igem Ethanol desinfiziert.
2. Bohren Sie ein 1,5 mm Durchmesser Bohrloch bei 2 mm und 5 mm posterior lateral des Bregma mit einem 0,7 mm Stahlkugel Grat Edelstahl (Abbildung 4).
   HINWEIS: Halten Sie die Dura intakt.
3. Die Sonde 0,5 mm über der Dura Oberfläche. Überwachen Sie den rCBF bei 0 (Baseline), 5, 15, 30, 60, 90 und 120 Minuten nach Embolisation und weiterhin bei 5, 15, 30, 45 und 60 min nach intravenöser Gabe von tPA. Nach der letzten Messung des rCBF wird die Kopfhaut Schnitt durch Naht geschlossen. Hinweis: Vor der Halsschnitt zu messen, wie wir rCBF Basislinie vor MCA Occlusion. Post MCA-Okklusion messen wir rCBF nach Nahtverschluss der Halsschnitt. Somit wird der Halsschnitt steril gehalten.

5. postoperativen Versorgung

1. Injizieren von 2,5 ml Kochsalzlösung subkutan in eine Dehydratation zu vermeiden und injizieren Buprenex (0,05 mg / kg, sc) unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff und alle 6-12 Stunden nach Schmerzlinderung benötigt wird.
2. Stoppen Isofluran-Narkose. Legen Sie die Ratte in einem 37 ° C Tierauffangkammer (Tier halten warm) und halten Beobachtung. Es dauert in der Regel 10 Minuten für die Ratte aus der Narkose zu erholen. Dann legte das Tier in einem Käfig sterilisiert, legen etwas benetzt Essen in einer Petrischale in den Käfig und den Käfig zurück zu Tiersterilisationsraum.
3. 24 Stunden nach einem Schlaganfall, die Ratte einschläfern mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg Körpergewicht, IP).

6. neurologisches Defizit Score

1. Führen Sie die Bederson Punktzahl vor und bei 2 h nach der Embolisation. Verwenden Sie einen Sortier sCale von 0-3 wie zuvor beschrieben, ^5: 0, die Erhöhung der Ratte durch Schwanz, das Tier, die sich beide Vorderbeine auf den Boden sind und keine andere Defizite (normale Bewegung); 1, die Erhöhung der Ratte durch Schwanz, biegen die kontralateralen Vordergliedmaße; 2, verringerte Widerstand gegen seitliche push (und Vordergliedmaße Flexion) ohne kreisen; 3, das gleiche Verhalten wie Grad 2 mit kreisenden.
   HINWEIS: Die Ratten, die Bederson Score = 0 (kein Defizit) bei 2 h nach der Embolisation werden vom weiteren Studium ausgeschlossen.

Ergebnisse

Laser-Doppler-Flußmessung (LDF) wurde verwendet, um rCBF während der Induktion der cerebralen Ischämie ^6,7 überwachen. Viele Labors einschließlich unserem Labor wurden mit rCBF, Tiere mit erfolgreichen MCA-Okklusion zu identifizieren, aber die Schwellen von Basislinie zwischen Laboratorien, die an den Ort der Messung verbunden sind unterschiedlich. Die Sonde der LDF ist 2 mm posterior positioniert und 5 mm lateral zum Bregma, wie zuvor ⁶ beschrieben. rCBF wurde bei 0 überwacht, 5, 15, 30, 60,...

Diskussion

In dieser Studie haben wir gezeigt, ein Standardverfahren zum Durchführen einer embolischen Schlaganfall MCAO-Modell in der Ratte, bei dem der Ursprung der MCA wird von einem Fibrin-reichen Gerinnsel verstopft. Der große Vorteil dieses Modells ist: der Verschluss der Stamm der MCA mit einem Fibrin-reiche Blutgerinnsel ist ähnlich thromboembolischen Schlaganfall bei Menschen ist die embolischen Schlaganfall-Modell geeignet für die Durchführung der präklinischen Untersuchung der Fibrinolyse, und dass dieses Modell e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607